新疆第六师农业科学研究所, 五家渠, 830000
作者
通讯作者
《分子植物育种》印刷版, 2016 年, 第 14卷, 第 23 篇
收稿日期: 2016年05月17日 接受日期: 2016年06月17日 发表日期: 2016年06月23日
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《分子植物育种》印刷版, 2016 年, 第 14卷, 第 23 篇
收稿日期: 2016年05月17日 接受日期: 2016年06月17日 发表日期: 2016年06月23日
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摘 要
本研究以新疆郁金香种植区植株和进口种球为材料,利用特异性引物,对侵染郁金香的主要病毒黄瓜花叶病毒(CMV)、碎色病毒(TBV)的一步法RT-PCR分子检测技术进行了初步研究。根据两种病毒的基因序列,合成了两对特异性引物,并对RT-PCR中的引物浓度、退火温度和反应循环数等因素进行了筛选和优化。研究显示,阳性对照和带病毒植株均扩增出了与预期大小一致的特异性条带,而健康植株无任何扩增产物。一步RT-PCR的最佳反应体系为:模板RNA 1 μL,2×1 Step Buffer 25 μL,上、下游扩增引物各1 μL,Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μL,加RNase Free ddH2O至50 μL。黄瓜花叶病毒(CMV)和碎色病毒(TBV)特异性引物的最佳反应程序:cDNA合成50℃ 30 min;预变性94℃ 2 min,变性94℃ 30 s,退火(CMV)56℃/(TBV)52℃ 30 s,然后72℃延伸1 min,30个循环,最后72℃延伸10 min。实验表明,种植区内栽培一年的郁金香植株部分已被CMV和TBV侵染,其中还有复合侵染的现象存在。本研究建立了基于核酸水平的高灵敏度的一步RT-PCR法郁金香病毒检测技术,能准确的检测出植株中的TBV和CMV,适用于郁金香黄瓜花叶病毒(CMV)、碎色病毒(TBV)的鉴定和检测,为脱毒组培苗的检测和脱毒体系的建立提供理论依据和技术支撑。
关键词
郁金香;one-step RT-PCR;病毒检测