张继友^1* , 景晓辉^2* , 吴伦英^1* , 刘国道³ , 吴琳⁴

1 海南大学农学院, 海口, 570228;
2 北京大学生命科学学院, 北京, 100871;
3 中国热带农业科学院品种资源研究所, 儋州, 571737;
4 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所, 海口, 571101;
*同等贡献作者
作者    通讯作者
《分子植物育种》印刷版, 2015 年, 第 13卷, 第 30 篇   doi: 10.13271/j.mpb.013.000915
收稿日期: 2014年11月10日    接受日期: 2015年02月27日    发表日期: 2015年03月13日

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开展原生质体融合育种以及利用原生质体瞬时表达系统进行分子生物学实验的前提和基础是建立高效、有活力的原生质体制备体系。为建立热研4号王草原生质体制备体系，本研究以热研4号王草叶片为原生质体制备的外植体，将切成细丝的热研4号王草幼叶置于含2.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶Y-23＋0.5%崩溃酶＋0.6 mol/L甘露醇＋40 mmol/L KCl＋6 mmol/L MES，pH 5.7＋20 mmol/L CaCl₂＋0.15% BSA的酶液中，在避光条件下置于50 r/min的摇床酶解6~8 h，获得了大量有活力且均匀一致的原生质体。经过荧光素双醋酸酯(fluoresceindiacetate, FDA)染色和Western blot检测目的蛋白表达，结果发现采用酶解法制备的热研4号王草原生质体活力可达75%，且可用于表达拟南芥外源蛋白。本研究可为下一步利用热研4号王草开展分子生物学研究奠定基础。

热研4号王草；原生质体制备；酶解法；荧光素双醋酸酯染色；Western blot