姜倩倩¹ , 陈磊¹ , 李正男¹ , 尹启琳¹ , 张立培² , 赵吉强¹ , 宋建成^1*

1烟台大学生命科学学院,烟台, 264005; 2烟台吉恩生物科技有限公司,烟台, 264006
作者    通讯作者
《分子植物育种》印刷版, 2021 年, 第 19卷, 第 18 篇   
收稿日期: 2020年03月13日    接受日期: 2020年03月20日    发表日期: 2021年06月26日

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本研究以 10~12 d苗龄的多年生黑麦草品种 NUI 叶片为材料，通过正交实验确定原生质体分离的最佳条件。结果表明，在甘露醇浓度为 0.5 mol/L、纤维素酶 R10浓度为 1%、离析酶 R10浓度为 0.3%的酶解液中，28℃黑暗条件下酶解 4 h后分离的原生质体最为理想，原生质体浓度达到 4.69伊106个/mL，活性达到88.59%。将能表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的重组质粒 pAN580利用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)介导法转化原生质体后，观察到强烈的绿色荧光信号，表明分离的黑麦草原生质体可以用作基因瞬时表达体系。遗传转化正交实验结果表明，在原生质体浓度为 2×10⁵个/mL、质粒浓度为 1 000 ng/mL、转化时间为 25 min，PEG-4000浓度为 40%的条件下，转化效率可达 67.51%，可以满足对 CRISPR/Cas9基因编辑载体进行编辑效率快速检测的要求。综上所述，本研究建立了一套快速、高效的原生质体瞬时表达体系可为多年生黑麦草基因编辑载体的快速鉴定验证及功能基因组研究提供有效的工具，不仅为深入开展多年生黑麦草的功能基因组学研究提供了基础，也为其在种质创新领域和分子育种层面的研究能利用基因工程的方法提供了依据。
 

多年生黑麦草(Lolium perenne L.)；原生质体；分离；转化；瞬时表达