周天顺^1,2* , 余东^2,3* , 董皓^1,2 , 孙志忠^2,3,4 , 孙学武^{2,3SUP> , 谭炎宁2,3 , 盛夏冰2,3,4 , 段美娟4** , 袁定阳1,2,3}

1 湖南大学研究生院隆平分院, 长沙, 410125; 2 湖南杂交水稻研究中心杂交水稻国家重点实验室, 长沙, 410125; 3 湖南省农业科学院, 长沙,410125; 4 湖南农业大学农学院, 长沙, 410128
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《分子植物育种》印刷版, 2019 年, 第 17卷, 第 16 篇   
收稿日期: 2018年06月11日    接受日期: 2018年06月20日    发表日期: 2019年07月21日

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TA 克隆是 PCR 产物克隆最简单的方法，而 T 载体的改良对提高 TA 克隆效率、简化克隆片段后续的酶切、连接等实验步骤有着十分重要的意义。本研究以 pMD18-T 载体为基础，将原有的氨苄青霉素抗性筛选标记基因替换成卡那霉素抗性筛选标记基因，克服了原载体筛选抗性(氨苄青霉素)容易失活的问题，并在原有酶切位点的基础上增加了 NsiⅠ、BsaⅠ、BglⅡ、NheⅠ和 A clⅠ五个酶切位点，方便了克隆片段后续的酶切和连接操作，同时在 XbaⅠ和 BglⅡ之间引入了两个 Eam1105I 限制性核酸内切酶位点，构建成一个环状中间载体 p18KT-M。利用 Eam1105I 酶切中间载体 p18KT-M 可以制备 3' 端带有 T 尾的线性化 p18K-T 载体。经 TA克隆验证，p18K-T 载体连接 PCR 产物的效率与原 pMD18-T 载体的效率相当。

TA 克隆；pMD18-T 载体；p18K-T 载体；Eam1105I 限制性核酸内切酶