蝴蝶兰(Phalaenopsis)是兰科植物中观赏价值最高、商品化最好的一个属，品种众多。为热带兰中珍品，享有“兰中皇后”的美誉(胡松华, 2003, 中国农业出版社, 56-68)，已成为世界第二大盆栽观赏植物(Chang et al., 2009)。

中小花型蝴蝶兰品种具叶挺美观、小巧新颖、花色丰富、花型多变、分枝性好、花量大、部分有香味、花期长等独特优点，精致包装成组合盆栽适宜办公室、家庭、商业空间布置，凸显其独特魅力与低碳、环保的理念，逐渐成为消费市场新宠，市场潜力巨大；是蝴蝶兰新品种培育的重要目标之一(李娜等, 2009)。

种质资源是培育优良品种的物质基础，明确不同种质间的遗传多样性与亲缘关系对育种以及种质遗传变异具有重要意义(Paterson et al., 1991)。目前，蝴蝶兰属种间与种内遗传变异在形态(李娜等, 2009; Christenson, 2001)、细胞(Lin et al., 2005; 庄东红等, 2007)和分子水平(明凤等, 2003; 赵谦等, 2008; 谢启鑫等, 2010; 李敏等, 2010; 张淑红等, 2009, 江苏农业科学, 2: 77-78)上已有一些研究，但研究多集中于大花型蝴蝶兰品种。利用形态学结合分子标记技术针对中小花型品种资源的评价、鉴定和研究基本处于空白。

序列相关扩增多态性(sequence related amplified polymorphism, SRAP)是一种新的DNA分子标记技术。具简单、可重复、高共显性、谱带易分离及分布均匀等优点，已在多种植物种质资源遗传亲缘关系分析、评价鉴定、杂交优势预测、遗传性状QTL标记、基因定位与克隆分析等领域广泛应用(Ferriol et al., 2003; 李莉等, 2006; 李媛媛等, 2007; 王建设等, 2007; 易杨杰等, 2008; 李梅等, 2009; 周艳霞等, 2009; 蹇黎和朱利泉, 2010)。

本研究以31个不同类型的中小花型蝴蝶兰种质为材料，利用传统形态学与SRAP分子标记技术比较分析其遗传多态性和亲缘关系，以期为中小花型蝴蝶兰优势杂交亲本选配、新品种选育和种质资源科学合理利用提供依据。

1结果与分析
1.1形态学聚类分析
以23个生物学指标为原始数据，标准化后采用欧氏距离、类平均法进行聚类分析，获得亲缘关系聚类树状图(图1)。根据遗传距离的远近将31个供试材料划分为4大类群。第Ⅰ类群包括Ph-R211、阿嬷、Ph-R216、Ph-R301、Ph-R312、Ph-R314、Ph-R303、Ph- R315、Ph-R305和Ph-R309共10个种质，表现为白色、米黄、浅粉红等浅色系花色，纸质花，花朵在4大类群中最小，典型的小花型种质。第Ⅱ类群共包括19个种质。其中萨拉黄金、Ph-R307、Ph-R210、Ph-R215和Ph-R219等5个种质聚为一个亚类，表现为黄色花瓣带斑点或斑块，花朵数少；满天红和Ph-R308聚为一个亚类；Ph-R212、Ph-R310、Ph-R311、Ph-R313、Ph-R316、Ph-R317和Ph-R318等7个种质聚为一个亚类，花瓣呈不同程度红色，具明显清晰网纹，分枝性好；Ph- R214、Ph-R218和兄弟女孩等3个种质聚为一个亚类，典型的中花型种质；Ph-R306和夕阳红均单独为一个亚类。种质Ph-R304单独为第Ⅲ类群，花瓣深紫红色带白边，花型奇特，唇瓣内凹成碗形、花瓣上有细小绒毛等。具香味、金黄色的种质小黄花单独为第Ⅳ类群。形态学聚类结果在一定程度上能把不同花色种质区分开来。
 

图1 31份中小花型蝴蝶兰种质的形态数据聚类图 Figure 1 Dendrogram of 31 Phalaenopsis germplasm in Small and Medium Sizes based on morphological traits

1.2 SRAP标记分析
1.2.1扩增产物多态性分析
从80个引物组合中筛选出条带清晰、稳定、多态性好的10对引物，对31个种质进行SRAP扩增。10对引物共扩增出DAN 片段153条，其片段大小为100~ 2 000 bp；其中多态性谱带130条，多态性比率为85.0 %；平均每对引物获得DNA谱带15.3条、多态性谱带13条(表1)。图2为引物组合me1-em3和me5- em8对31个材料的SRAP-PCR扩增指纹图谱。
 

表1 10对SRAP 引物组合的扩增情况 Table 1 Amplification results of SRAP primers for 31 phalaenopsis in small and medium sizes

 

图2 31个中小花型蝴蝶兰种质的SRAP指纹图谱 Figure 2 The genomic SRAP fingerprints of 31 phalaenopsis germplasm in small and medium sizes

1.2.2遗传相似系数与聚类分析
31份种质的遗传相似系数变化范围在0.36~ 1.0，均值为0.66。表明供试蝴蝶兰材料具有较丰富的遗传多样性。其中种质Ph-R317和Ph-R318间的遗传相似系数最高为1.0；种质Ph-R312与Ph-R314、Ph-R317、Ph-R318间的遗传相似系数为0.98，亲缘关系很近；而种质Ph-R314与Ph-R307间的遗传相似系数最低为0.36，亲缘关系最远。

利用UPGMA法对31份种质的SRAP 扩增结果进行聚类分析，建立亲缘关系聚类图(图3)。当遗传相似系数为0.57时，供试材料可划分为2大类群：第Ⅰ类群主要由9个黄色系种质组成；第Ⅱ类群主要由22个红色系、白色系种质组成。
 

图3 31份中小花型蝴蝶兰种质的SRAP遗传聚类图 Figure 3 Dendrogram of 31 Phalaenopsis germplasm in small and medium sizes constructed using UPGMA based on SRAP markers

第Ⅰ类群种质可进一步分为3个亚类。第一亚类包括Ph-R210、萨拉黄金、兄弟女孩、Ph-R219、Ph- R216和Ph-R211等6个种质，花瓣以不同程度黄色为主色，花朵稀少集中于花枝顶端；第二亚类由小黄花和Ph-R215组成，金黄色蜡质花瓣、较肥厚，略带香味；Ph-R307单独为第三亚类，浅绿色蜡质花瓣上具深紫红色斑块。

第Ⅱ类群种质可进一步分为6个亚类。第一亚类包括Ph-R214、Ph-R303、Ph-R310、Ph-R311、Ph-R312、Ph-R313、Ph-R314、Ph-R315、Ph-R316、Ph-R317和Ph- R318共11个种质，表现为粉红花瓣上具清晰紫红条纹、无斑点或杂色，花序整齐，花朵小，花朵数多，是典型的小花多花型种质；其中Ph-R310~Ph-R318等9个种质间的遗传相似系数大于0.80，亲缘关系很近，且表型性状相似度较高。白色绿心、小花、多花型种质阿嬷单独聚为第二亚类。白色红心、中花型种质Ph- R218单独聚为第三亚类。第四亚类包括Ph-R304、Ph-R305和Ph-R301，具独特的花型、花序。第五亚类包括Ph-R308、Ph-R309、Ph-R212、夕阳红和Ph-R306共5个种质，其中Ph-R308、Ph-R309与Ph-R212间的亲缘较近，中花型、深紫红花瓣具白边、翼瓣较尖锐。满天红单独为第六亚类。

2讨论
中小花型蝴蝶兰逐渐成为消费市场的新宠，具有很高的观赏和经济价值。较为全面地掌握种质资源的遗传多样性，可以减少新品种选育中亲本选配的盲目性，提高育种效率；同时也可以对一些同物异名或同名异物的品种进行准确鉴定。因此，开展中小花型蝴蝶兰种质资源的遗传多样性分析具有现实的指导意义。

本研究初次利用传统形态学与SRAP分子标记技术相结合的方法对中小花型蝴蝶兰种质的遗传多样性进行分析。基于表型聚类分析结果把31个种质划分为4大类群，花色相近的大部分能够聚为同一类，花色、花型及花质比较特殊的均单独聚为一类。SRAP分析结果表明，10对SRAP 引物组合共扩增出153条谱带，多态性谱带有130条，比率为85.0%；31份种质的遗传相似系数变化范围为0.36~1.0，均值为0.66。说明供试蝴蝶兰材料间存在较为丰富的遗传多样性。这与(谢启鑫等, 2010; 李敏等, 2010)所得结论基本一致。

形态学聚类结果与分子聚类结果不完全一致，既有重叠，又有不同。如形态与分子聚类均能把黄色系种质聚为同一类，能把种质Ph-R312与Ph-R314聚为同一亚类，能把种质Ph-R311、Ph-R313、Ph-R316、Ph-R317和Ph-R318聚为同一类。从整体来看，分子聚类与形态聚类结果又有较大差异。如种质小黄花在形态聚类中单独为一类，而在分子聚类中却与其它黄色系种质聚为一类；种质阿嬷、满天红在分子聚类中均被单独聚类；种质Ph-R317和Ph-R318在分子聚类中认为是同一基因型的材料，而在形态聚类中被聚为不同亚类；具有独特花型的种质Ph-R304在形态标记中被单独聚类，而在分子标记中与具有相同花型的种质Ph-R305聚为同一亚类。造成这种差异的主要原因是形态学标记的原始数据易受到环境、人为因素的影响，揭示的是基因与环境互作的差异，且形态相近时，表型分辨能力有限，从而使形态标记在一定程度上未能完全真实反映种质的遗传多样性。分子标记揭示的是种质在DNA 序列上的差异，消除了环境、人为因素的影响与干扰，稳定性和可信度相对较高。从整个分析结果可见，两种标记结果互有优缺点，但SRAP分子标记结果更能反映出种质间的亲缘关系。因此，应综合应用多种遗传标记，才能更准确、可靠的评价鉴定中小花型蝴蝶兰种质遗传多样性，为种质改良、新品种选育奠定物质与技术基础。

3材料与方法
3.1供试材料
本试验材料共31份(图4)，均保存于福建省农业科学院花卉研究中心种质资源圃，所有供试材料的花径均小于9 cm，归属于中小花型。
 

图4 试验材料 Figure 4 Testing Materials

3.2试验方法
3.2.1田间性状测定及数据分析
每个种质选择有代表性的10株进行性状测定与采集。质量性状包括萼片颜色、花瓣颜色、唇瓣颜色、花有无网纹和斑点、花有无香味等6个指标；数量性状包括叶片数、叶片大小、抽梗数、花梗长、花瓣长宽、唇瓣长宽、萼片长宽、花径、花朵数、分枝数及侧枝长等11个指标。为了便于统计分析，质量性状赋予0~8不同的数值，原始数据标准化后利用DPS软件进行聚类分析。

3.2.2基因组DNA提取
取不同种质同一生长期新鲜花瓣提取基因组DNA，提取方法在CTAB法(Murray and Thompson, 1980)基础上改进。所用药品试剂、引物等均购自上海Sangon公司。

3.2.3 SRAP分析
按照(Li and Quiros, 2001)等提出的SRAP 引物的设计原则设计引物。SRAP-PCR反应体系25.0 μL，其中10×Buffer溶液(包含Mg²⁺) 2.5 μL、2.5 mmol/L 的dNTPs溶液2.0 μL、Taq DNA聚合酶0.28 μL、10 mmol/L正反引物各1.0 μL、模板DNA (120ng) 1.0 μL。采用变温复性反应程序：前5个循环35℃复性，后30个循环50℃复性；最后72℃延伸9 min。反应在ABI-9700 PCR仪上进行。扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶、120V恒压电泳，以DL2000 DNA marker 为对照，溴化乙锭染色后紫外凝胶成像仪观察照相。

3.2.4数据处理与分析
根据电泳结果，每个样品中存在的稳定条带记作1，缺失的记作0，强带和可重复弱带均记作1，采用Excel统计软件建立原始数据0、1矩阵。采用DPS统计软件对原始数据矩阵进行分析，按类平均法(UPGMA)建立各种质间的聚类图。

作者贡献
钟淮钦是本研究的实验设计和具体执行人，主要完成实验数据的采集、分析及论文初稿写作；钟海丰、樊荣辉参与实验室的部分操作；林兵、吴建设参与供试材料的田间栽培管理、数据观测；黄敏玲为项目的构思者和负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由福建省科技重大专项专题1 (2010NZ0003-1)和福建省公益类科研院所专项(2011R1028-6)共同资助。

参考文献
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