胡萝卜(Daucaus carota L.)是伞形科(Umbelliferae)胡萝卜属的二年生草本植物。具有可食用且营养丰富的肉质直根，被世界许多国家公认为上等蔬菜。因其天然蛋白含量可达0.7%~1.2% (Hardegger and Sturm, 1998)，人们常利用胡萝卜作为植物生物反应器生产药用蛋白(赵秀英等, 2002; 张丽华等, 2005;  2006; Mikschofsky et al., 2009; Luchakivskaya et al., 2011)。作为基因转化经典受体，早在20世纪70年代就有科研工作者对其进行遗传转化研究，目前国内对其进行遗传转化的外植体多为胚轴、块根和愈伤组织，子叶也偶有涉及；对其细胞进行农杆菌转化相对前者嵌合体少，转化率高，但报导较少(刘稚等, 1987, 中国科学B辑, 5: 507-512; 李名扬和唐岱, 1989; 刘明志, 1996; 程玉鹏等, 1999)，很多影响因素还没有人摸索。2009年Mikschofsky等人的研究表明通过优化培养条件可以使兔出血症病毒VP60衣壳蛋白在胡萝卜细胞干物质的产量中达2.4 μg/g，为利用胡萝卜细胞生产药用蛋白提供了新的技术支持。

白细胞介素-4 (interleukin-4, IL-4)是一种结构复杂、功能广泛的免疫调节因子，对B细胞、T细胞、粒细胞、单核细胞和造血细胞都有免疫调节作用。对多种疾病具有预防和治疗的作用(胡洪慧等, 2005, 中国药学杂志, 40(10): 721-725)。

把人的白细胞介素-4基因转入胡萝卜细胞，可利用细胞培养大量生产该药用蛋白；同时还可获得转该基因胡萝卜，因胡萝卜可凉拌生食，能避免因高温蒸煮而导致蛋白活性破坏，长期定量食用该胡萝卜定会起到防病和治病的作用。

本研究正是基于以上多方面考虑，一方面丰富了细胞遗传转化理论，对影响胡萝卜细胞转化的相关因素进行了优化；另一方面为药用蛋白IL-4的生产提供技术支持；同时有利于胡萝卜的产业化开发，具有巨大的潜在社会效益和经济效益。

1结果与分析
1.1卡那霉素筛选浓度的确定
本品种胡萝卜对卡那霉素耐受性很低，当卡那霉素浓度等于或大于10 mg/L时，胚轴已不分化；当卡那霉素浓度为5 mg/L时，胚轴有少量的生长(图1)。据此，在筛选转化细胞时，我们将卡那霉素的选择浓度定为5 mg/L；筛选转化愈伤组织时，我们将卡那霉素的选择浓度定为7.5 mg/L；筛选转化再生苗时，我们将卡那霉素的选择浓度定为10 mg/L。
 

图1 胚轴外植体对不同Kan浓度的反应 Figure 1 Response of hypocotyl explants under different Kan concentration

1.2头孢曲松钠浓度的确定
本品种胡萝卜对头孢曲松钠不敏感，在其含量为200~500 mg/L的培养基上胚轴都能够正常分化。据此，确定筛选培养基中头孢曲松钠浓度为500 mg/L，在继代过程中降至200 mg/L。

1.3胡萝卜悬浮培养细胞遗传转化体系的优化
胡萝卜悬浮培养细胞(图2A)经农杆菌C-P2转化后接种到固体培养基上，培养1周后个别培养皿即可观察到抗性细胞团的发生(图2B)；培养6周后分化出的抗性细胞团约0.5 cm³ (图2C)；培养12周以上得到抗性再生苗(图2D)。待抗性植株达3片真叶时，进行PCR检测。以PCR重复扩增三次皆为阳性作为鉴定阳性植株标准，并计算转化率(转化率=PCR阳性株/筛选标记抗性株×100%)，试验因素水平见表1，数据统计及其直观分析见表2。
 

图2 胡萝卜细胞及其转化后的再生状态 Figure 2 Carrot suspension cells and regeneration state in different periods after transformation

 

表1 因素水平表 Table 1 Factors and Levels

 

表2 胡萝卜悬浮培养细胞遗传转化的正交试验结果直观分析表 Table 2 Visual analysis of orthogonal test results in carrot suspension cultured cells genetic transformation

从表2的数据分析结果可见：对胡萝卜悬浮培养细胞转化率的影响，胡萝卜细胞与农杆菌细胞的比例B>预处理天数A>共培养天数C，其中以胡萝卜细胞与农杆菌细胞的比例B对胡萝卜悬浮培养细胞转化率的影响最大。我们对表2转化率反正弦转换后的数据进行了方差分析，结果表明，A因素(F值为0.88, *F_2,2,0.05=19)和C因素(F值为0.02, *F_2,2,0.05=19)不同水平间的处理效应没差别，B因素(F值为44.83*, *F_2,2,0.05=19)水平间的差异显著。由于A、C因素方差皆小于1，我们将其并入误差项后，做了进一步方差分析，B因素水平间的差异达到了极显著(F值为70.7**, **F_2,6,0.01=10.93)。由此可见：预处理时间1~3 d和共培养时间1~3 d对转化率的影响不大，而胡萝卜细胞与农杆菌细胞比例(B)才是影响转化率的关键因子，胡萝卜细胞与农杆菌细胞的比例范围在1:10至1:100间差别不大，比值继续增大则转化率降低。因此，试验处理组合应以包含B1和B2水平的处理组合为佳。

考虑到悬浮培养细胞在进行转化试验后的体细胞胚植株的分化率，本次试验的最佳转化体系确定为A1B1C1，不但分化率高，获得的筛选标记抗性植株多，而且PCR阳性植株也多，转化效率较高。

1.4转基因植株的PCR扩增
以抗性再生植株的总DNA为模板进行il-4的PCR扩增。部分扩增结果见图3，在DL2000 marker 250~500 bp之间大约400 bp的位置为目的条带，空白对照(水)和阴性对照(未转化植株)无特异条带，而部分DNA样品和两个阳性对照均可见清晰的条带。
 

图3 转iL-4基因植株PCR检测 Figure 3 PCR analysis of transfered iL-4 gene plants

1.5转基因植株的PCR-Southern检测
随机选取6株经PCR鉴定为阳性的植株，用il-4上下游引物对其进行PCR扩增和PCR-Southern杂交检测，结果如图4所示：空白对照、阴性对照(未转化植株) 无杂交带，两个阳性对照均有杂交带，说明PCR结果是可靠的，初步证实il-4基因已转入胡萝卜中。
 

图4 PCR-Southern blot检测结果 Figure 4 Results of PCR-Southern blot

1.6转基因胡萝卜的获得
待胡萝卜抗性组培苗长至苗高7~8 cm，即有6~7片真叶、根系也较发达时，先在组培瓶中进行7 d左右的开瓶昼夜变温炼苗(昼温22℃, 夜温14℃)，然后用贮存水洗掉根部培养基，并移栽到以纯蛭石为基质的营养钵中。移栽后的最初4 d，要进行严格的保湿处理，待移栽后的小苗长出新叶时(约2周左右)，再将其移栽到装有草炭:蛭石=1:1的营养钵中，一周后转移到温室中进行常规管理，90 d后收获转基因胡萝卜。

2讨论
进行基因遗传转化研究者的追求目标之一是较高的遗传转化效率。转化过程中的各种因素都能够影响农杆菌介导的植物细胞遗传转化效率。因此本试验对转化过程中的3个较主要因素：细胞预培养时间、细胞与农杆菌的比例与共培养时间进行了优化。对于农杆菌侵染植物组织或器官外植体而言，侵染前对外植体进行合理的预培养，可以使外植体保持活跃的生长代谢状态，减少外植体转化过程中的杂菌污染，促进细胞分裂，而分裂状态的细胞更容易整合外源DNA，因而提高外源基因的瞬时表达和转化率(王关林和方宏筠, 2002, 科学出版社, pp.391-392)。但对于细胞外植体而言：本研究发现细胞经1~3 d的预培养，都能够获得较高的转化率，与刘稚等人的研究细胞年龄在l~15 d范围内对转化几乎没有影响相一致(刘稚等, 1987, 中国科学B辑, 5: 507-512)；而与李名扬和唐岱(1989)的研究细胞预培养3~5 d再进行转化是获得较高转化频率的最佳时期略有差别；而与刘明志(1996)的研究细胞预培养1~2 d不能得到抗性克隆，只有预培养3 d再进行转化才能得到抗性克隆差别较大。可见农杆菌对不同基因型的侵染能力不同，那么在植物细胞遗传转化操作时，预培养时间的长短只能根据其基因型而定，不能一概而论。植物细胞与农杆菌细胞的比例是实现农杆菌转化获得转基因植株的关键因素，比例过高或过低都不能或不利于抗性组织的获得，本研究表明植物细胞与农杆菌细胞的比例为1:10或1:100对转化率影响不大，这与刘稚等人的研究结果基本一致(刘稚等, 1987, 中国科学B辑, 5: 507-512)；当比例达到1:1 000没能获得转化细胞，与李名扬和唐岱(1989)的研究结果：“细菌的加入量以900~1 000个细菌/植物细胞为宜”稍有差别，而刘明志(1996)对此因素没有筛选直接用了1:100，也得到了较好的转化效果，看来这一因素与基因型相关性不大基本以1:100为最佳条件。此外，植物细胞与农杆菌细胞的共培养时间也会对转化效率有影响，本试验结果表明当植物细胞与农杆菌细胞共培养时间1~3 d时对转化率基本没有影响，这与刘稚等人的研究结果基本一致(刘稚等, 1987, 中国科学B辑, 5: 507-512)，而与刘明志(1996)的研究结果有差别，可见这一因素对转化率的影响也因基因型不同而有差别。

在农杆菌介导的植物遗传转化试验中，通常添加两种抗生素，一种是抑制非转化细胞生长，需根据标记基因而定；另一种是抑制农杆菌生长，常用的有头孢类抗生素或青霉素类抗生素等(王关林和方宏筠, 2002, 科学出版社, pp.395)。不同植物、不同基因型对这两类抗生素的敏感性不同，使用剂量需根据预试验确定。本次试验中这两个因素的筛选是以胚轴为外植体而非细胞，是因为转化后细胞是在固体培养基上培养，一般1~2 d内细胞就已开始分裂，这样对其筛选的就是转化细胞群而非单个细胞。本次试验确定的筛选浓度Kan 7.5 mg/L，在其上培养的抗性细胞团分化出了白化苗，从这一角度看这个浓度是一个较合适的浓度；但以PCR阳性植株数与Kan抗性植株数比值计算出的转化率普遍偏低，从这一角度看这个浓度略有偏低。转化率偏低不仅与筛选浓度有关，与PCR扩增结果假阴性也有关，我们在试验中发现有的模板DNA需要稀释到5 000倍才能扩增出来，但由于试验强度大(我们同时还做了对其胚轴的转化工作)，只有少部分样品稀释过。对于抑菌素，由于本基因型胡萝卜对头孢曲松钠不敏感，没有做其对农杆菌侵染的胡萝卜抑菌效果试验，根据本实验室前期工作(李然红等, 2007)，将其定为500 mg/L，并降至200 mg/L，既抑制住了农杆菌生长，又得到了抗性苗，可见抑菌素浓度的选择还是较合适的。

3材料与方法
3.1试验材料的获得
菌种：将本实验室构建的质粒P2IL4 (图5)转入根癌农杆菌菌株C58C1 (pMP90, Rif^r)中，命名为C-P2菌株。
 

图5 P2IL4质粒的部分图谱 Figure 5 Part scheme of P2IL4 plasmid map

胡萝卜悬浮培养细胞：将开拓者(其种子来源为辽宁园艺种苗有限公司出售的商业用种) 7日龄无菌苗的下胚轴上段切成约1 cm长，接种于添加2,4-D 1.0 mg/L的MS培养基上。培养10 d后，每4个胚轴转接到添加2,4-D 1.0 mg/L的20 mL MS液体培养基的100 mL三角瓶中。培养条件(25±1)℃，90~100 rpm。每7 d更换一次培养基：并用100目不锈钢筛网过滤，4 000 rpm离心5 min收集细胞。连续继代3次以上所得胡萝卜悬浮培养细胞待用。

根癌农杆菌侵染液：挑取于-80℃冰箱取出的菌种C-P2，经两次平皿活化，挑单菌落接种于15 mL含Rif 50 mg/L 和Kan 30 mg/L的LB液体培养基中，28℃，黑暗条件下200 rpm振荡培养。24 h后按1:25进行扩大培养。3~6 h后测取OD₆₀₀为0.6的菌液待用 。 

3.2卡那霉素筛选浓度的确定
取7日龄开拓者无菌苗的下胚轴为外植体，分别接种于含卡那霉素为0、5 mg/L、10 mg/L和15 mg/L的胚性愈伤组织诱导培养基上(高金秋和于丽杰, 2009)。每个培养皿接种15个外植体左右，每种培养基至少30个外植体，四周继代一次，30 d后观察下胚轴的分化情况，以确定其对卡那霉素的抗性本底。

3.3头孢曲松钠浓度的确定
取7日龄开拓者无菌苗的下胚轴为外植体，分别接种于含头孢曲松钠为0、200 mg/L、300 mg/L和500 mg/L的胚性愈伤组织诱导培养基上。每个培养皿接种15个左右外植体，每种培养基至少30个外植体，四周继代一次。30 d后观察下胚轴的生长情况，以确定适宜的抑菌剂浓度。

3.4胡萝卜悬浮培养细胞遗传转化体系的优化
采用正交表L₉(3⁴)设计试验,优化胡萝卜悬浮培养细胞的遗传转化体系，因素水平选取见表1，试验处理组合见表2。取新更换培养基的胡萝卜悬浮培养细胞进行预处理即在(25±1)℃，90~100 rpm下培养不同天数，预处理结束后用100目不锈钢网过滤，取部分滤过液测OD₆₀₀值，然后按胡萝卜细胞1 OD₆₀₀约等于6.5×10⁵个/mL (本试验周期, 前期的多次平均值)和农杆菌细胞1 OD₆₀₀约等于8×10⁸个/mL (王关林和方宏筠, 2002, 科学出版社, pp.387)，按表1数目比在15 mL胡萝卜悬浮培养细胞中添加一定体积的农杆菌菌液进行侵染。添加菌液后就开始进行共培养计时，共培养结束后，用含Kan 5 mg/L、Cef 500 mg/L和2,4-D 0.5 mg/L的MS液体培养基洗涤悬浮细胞10次，洗涤时用4 000  rpm离心5 min。洗涤后用100目的不锈钢网过滤，并取样分测OD₆₀₀值，再按所测OD₆₀₀值调整细胞数为5×10⁴~10×10⁴个/mL。取1 mL均匀滴加于铺有含ZT 0.2 mg/L、Kan 5 mg/L和Cef 500 mg/L MS固体培养基的9 cm培养皿中，每个组合6皿，用石蜡膜封皿，放在培养室中培养。培养条件为23℃~27℃，光强为1 500~2 000 Lux，每天光照16 h，培养室湿度保持在45%~65%。8周后转含Kan 7.5 mg/L和Cef 200 mg/L MS培养基，4周后转含Kan 10 mg/L和Cef 200 mg/L MS培养基，以后依此条件每四周继代一次。3个月后长成可移栽的抗性健壮苗。

3.5转基因植株的PCR检测
根据il-4基因序列，本实验室设计了PCR的上、下游引物，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。取开拓者抗性再生植株叶片100~200 mg以CTAB法(王关林和方宏筠, 2002, 科学出版社, pp.744)提取总基因组DNA为模板，以含il-4的质粒DNA和含有il-4的质粒DNA与未转基因植株提取的总DNA混合物为阳性对照，以未转基因植株总DNA为阴性对照，以无菌水为空白对照，进行PCR扩增。PCR反应体系为：1 μL的10×PCR Buffer、0.08 μL的rTaq (5 U/μL)和0.8 μL的dNTP (2.5 mmol/L each)，此三种试剂由大连宝生物有限公司提供；上下游引物各0.1 μL (20 μmol/L)；模板DNA 1 μL；添加无菌水至10 μL。PCR扩增反应程序为：预变性，95℃ 5 min；变性，94℃ 1 min；退火52.6℃ 30 s；延伸72℃1 min；35次循环；72℃再延伸10 min；保温于4℃。将PCR产物加入2 μL溴酚蓝后全部上样，通过电泳分离检测，琼脂糖凝胶浓度为1.2%。

3.6转基因植株的PCR-Southern检测
见DIG high prime DNA labeling and detection starter kit Ⅰ (Roche)操作说明。

作者贡献
于丽杰是项目构思者及负责人，并对论文数据和初稿进行了修改；高金秋和陶雷是本研究的试验设计和试验研究的执行人；高金秋完成了初稿的写作和数据分析。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由黑龙江省自然科学基金(C0014)、黑龙江省普通高等学校骨干教师创新能力资助计划共同资助。

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