韭菜(Allium tuberosum Rottl. ex Spreng)为百合科葱属的多年生草本植物，主要以叶片、假茎供食，为我国特有的一种蔬菜。韭菜既可以种子繁殖，也可以进行无性繁殖，但是在生产中大多采用多年生的方式进行生产，而不是采用种子繁殖的方式。因此，在育种中不像其他的蔬菜如茄果类和叶菜类等方便进行杂交育种。随着生物技术的发展，转基因育种技术已经成为现代育种的一个重要途径(闫新甫, 2003)。虽然葱蒜类蔬菜是难于进行转基因的一类作物，但是目前通过农杆菌介导的方法已经获得了洋葱(Eady et al., 2003)、大蒜和韭葱(Eady et al., 2005)等转基因植株。而根癌农杆菌介导转基因系统建立的前提条件是再生体系的完善，因此，建立韭菜高效的再生体系是其转基因的必要手段。

早在1977年，Zee等(1977)就已开始了韭菜组织培养的研究，他们通过培养韭菜无菌苗幼叶获得了再生苗，但植物的再生频率较低。近年来，国内外对韭菜组织培养的研究逐渐增多(张松等, 2002; 王明耀等, 2005; 王桂英, 2007; 屈二军等, 2008, 种子世界, 6: 24-25)，对再生体系和遗传转化的研究已经开始进行探索(张松等, 2003)，但是应用上的成果还未见报道，与其他蔬菜植物相比，相关研究开展的还较少；此外，在组培激素配方方面也存在差异。因此，本研究在前人研究的基础上，进一步筛选韭菜的再生体系，为生物技术育种和其它方面的应用奠定基础。

1结果与分析
1.1种子最佳灭菌方法的选择与无菌苗的获得
种子接种7 d后统计污染率和存活率，结果表明(表1)，用0.1%升汞或者20%次氯酸钠对韭菜种子消毒后，其污染率和存活率随着消毒时间的延长而显著变化。以先放入75%乙醇30 s，然后再用0.1%升汞消毒10 min的方法最好，污染率为0%，存活率高达88.91%，明显高于其它三种方法。一般7~9 d即可长成无菌苗(图1A)。

1.2不同激素组合对韭菜根尖芽分化的影响
激素类型及配比是决定植株再生的关键，本试验采用BA和NAA组合并在此基础上又加入了KT等不同激素组合进行韭菜根尖芽再生的试验。

1.2.1不同BA、NAA组合对韭菜根尖芽分化的影响
种子萌发后取0.3~0.5 cm的根尖接种于含不同浓度BA和NAA的MS培养基上，7 d后根尖切段开始伸长，10 d左右在根尖材料的切口处产生白色颗粒状愈伤组织(图1B)，以后在愈伤组织上进行不定芽的分化(图1E)，近根尖端却一直没有形成愈伤组织，仅膨大而已。比较几种BA和NAA组合对韭菜根尖芽分化的影响，以MS+BA 2 mg/L+NAA 1 mg/L培养基组合最为适宜，诱愈率和诱芽率分别为52.33%和45.33%，诱芽效果明显高于其它组合(表2)。

 
1.2.2不同BA、NAA和KT组合对韭菜根尖芽分化的影响
将根尖接种于不同浓度BA、NAA和KT组合的MS培养基上，7 d后在末端开始产生愈伤，10 d后在部分材料的切口处可见绿色不定芽(图1D)，之后出芽率逐渐增加，有的材料不定芽的产生未经过愈伤组织的诱导阶段而直接生芽(图1C)。几种配方比较的结果显示(表3)，在MS+BA 1 mg/L+NAA 1 mg/L+KT 1 mg/L培养基上，芽分化率最高达到38.89%；MS+BA 1 mg/L+NAA 2 mg/L+KT 1 mg/L培养基上的出愈率虽然高于MS+BA 1 mg/L+NAA 1 mg/L+KT 1 mg/L培养基，但是芽分化率低于MS+BA 1 mg/L+NAA 1 mg/L+KT 1 mg/L培养基。相比较而言，以MS+BA 1 mg/L+NAA 1 mg/L+KT 1 mg/L培养基效果最佳，与BA和NAA组合相比，该培养基长愈伤的能力较弱，诱芽能力较强，可以不经过愈伤诱导的过程直接诱芽。

 
1.3不同基因型对根尖芽诱导的影响
在MS+BA 1 mg/L+NAA 1 mg/L+KT 1 mg/L培养基上接种不同品种的根尖外植体，15 d后调查愈伤组织和不定芽分化情况，结果如表4所示。从表中可以看出，接种7 d后供试6份材料的外植体上均有颗粒状愈伤组织产生，15 d后开始分化不定芽。但不同品种间的出芽率和出愈率稍有差别，以“汉中冬韭”的愈伤组织和不定芽的分化频率最高，“河东宽叶冬韭”次之。

 
1.4不同激素组合对不定芽生根的影响
将不定芽接种到各种生根培养基约7 d后，除了在1/2MS+IAA 1.0 mg/L的培养基上不能生根外，其他激素组合的培养基均能生根，以IAA 0.3 mg/L生根数最多，如果激素浓度太高则抑制生根，比较基本培养基，MS高于1/2MS，因此，最佳生根培养基组合为MS+IAA 0.3 mg/L (表5; 图1F)。
 

 
2讨论
在植物的组织培养过程中，生长素和细胞分裂素起着非常重要的作用，生长素的功能是诱导愈伤组织形成，促进生根，而细胞分裂素则促进不定芽的再生，但是单独使用细胞分裂素则效果不明显。在番茄和白菜的再生体系建立过程中，均需要通过使用激素配方才能得到再生的植株(赵慧等, 2009; 张微等, 2010)。目前在韭菜的组织培养中用到的激素有生长素NAA和细胞分裂素BA、KT等，蔡小宁等(1997)认为培养基中生长素和细胞分裂素的比例会影响培养外植体中相应激素比例的变化，进而调节不定芽的诱导。张松等(2002)通过对韭菜组织培养过程中激素配比、外植体、基因型、苗龄及生根条件的研究，建立了一次性诱导成芽的高频植株再生体系，确定了适合于愈伤组织和不定芽分化的最佳培养基为MS+NAA 1 mg/L+BA 2 mg/L，本研究在张松研究的基础上加入了KT，并设置不同的组合，得到了芽分化的最佳培养基为MS+BA 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L，而且不定芽的分化有的为直接分化，不经过愈伤组织的诱导过程，有的经过愈伤组织的诱导过程，从时间上比较，该配方的芽分化时间早于BA、NAA组合，因此在芽分化方面用该配方要优于前者。由于不经过愈伤的形成阶段，所以形成的芽数少于前者，因此，在应用中可以根据需要进行选择。

3材料与方法
3.1植物材料和试验地点
试验材料选用生产中常用的“汉中冬韭”。不同基因型比较采用6个韭菜品种：中华韭王、特选原种791雪韭、紫根韭菜、河东宽叶冬韭、汉中雪韭王和汉中冬韭。试验于园艺学院组织培养室进行。

3.2种子灭菌方法筛选及无菌苗的获得
将韭菜种子用清水洗干净后，置入75%乙醇中浸泡30 s，然后转入0.1%升汞浸泡5 min和10 min，或者转入20%次氯酸钠溶液中消毒10 min和20 min，处理后的种子用无菌水冲洗3次，接种在1/2MS固体培养基中，在(25±2)℃的光照培养箱中暗培养3 d，当种子萌芽后，将其放到培养室培养。接种7 d后调查污染发生情况和种子萌发情况，通过统计被污染种子和萌发种子的粒数确定最佳消毒方法。每个处理接种10瓶，每瓶接种种子5粒，共50粒。

污染率=污染的种子粒数/接种种子总数×100%

萌发率=未污染的萌发种子粒数/未污染的接种种子总粒数×100%

3.3不同激素配比对愈伤组织及芽诱导率的影响
种子萌发后5~7 d，当无菌苗长成后，切取长约0.5 cm的根尖接种在不同激素组合的MS培养基上(含0.6%的琼脂粉和3%蔗糖)，30 d后观察出愈率和出芽率。每个处理接种5瓶，每瓶接种5个外植体。

出愈率=诱愈外植体数/接种数×100%

出芽率=诱芽外植体数/接种数×100% (下同)。

3.3.1不同BA和NAA组合
采用MS为基本培养基，将2.5 mg/L、2.0 mg/L、1.5 mg/L和1.0 mg/L BA与0.5 mg/L、1.0 mg/L和2.0 mg/L NAA进行随机配组，形成12种组合，从中选出诱芽的最佳培养基。

3.3.2增加KT后的组合
采用MS为基本培养基，将3.3.1中选出的组合加入KT，与已经报道的最佳激素配方进行比较，从中选出最优的组合，各组合激素组成如表6所示。

 
3.4不同基因型愈伤组织及芽诱导的比较
基因型对建立再生体系也是非常重要的，本试验选取生产中常用的6个韭菜品种，切取根尖接种在筛选出的愈伤组织及芽诱导的最佳培养基中，每个处理接种5瓶，每瓶接种5个，15 d后观察不同基因型愈伤组织及芽诱导的差异。

3.5不定芽生根培养基的筛选 
当不定芽长至1~2 cm时，将不定芽连同下面的愈伤组织切下接种在附加0、0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L和1.0 mg/L IAA的1/2MS和MS培养基中，共10个处理。每个处理10瓶，每瓶2个外植体。接种后15 d调查生根率和每株的平均根数，从而选出生根的最佳培养基配方。

生根率=生根芽数/芽总数×100%。

3.6无菌苗移栽
待根长成后，开瓶锻炼1~2 d，小心洗去根部的培养基后，栽至营养钵中，浇透水并进行适当覆盖，保湿1~2 d后揭开，培养2周后即可成为无菌苗。

3.7 培养条件
种子萌发时的培养温度为(20±2)℃，在组织培养过程中的培养温度为(25±2)℃，光照强度为4 000 lx，每日光照时间为16 h。

作者贡献
张学智和李梅兰是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；张彦良参与照片的拍摄和处理；马建平和李春琳参与实验设计和构思；高行英和侯文菊参与试验结果分析；侯雷平是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由山西省农业科技攻关项目(20090311022; 20110311015-1)和山西省人事厅人才引进项目资助完成，全体作者在此深表感谢。另外，在试验的进行过程中得到实验中心田彩芳和王彦芳老师的热情帮助，在此表示十分的感谢。

参考文献
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