水稻是世界重要的粮食作物，也是近一半中国人的口粮。日前，随着人口与可耕地面积间矛盾的凸显，加快新品种的育成与推广至关重要。近年来，参加区试的新品种每年呈递增趋势，这虽然为品种的更替提供了契机，然而由于传统的水稻新品种特异性、一致性和稳定性(DUS)的测试存在鉴定周期长、鉴定结果易受环境影响等局限性，给新品种的鉴定和市场监管带来了很大麻烦，从时推广。SSR标记具备数量丰富、共显性遗传、信息含量高以及分析方法简便、可重复性好等特点，水稻品种的DNA指纹图谱标记可以从分子水平鉴定品种间的异同，从而更加科学准确的判定新品种的DUS。目前国际新品种保护联盟(UPO而严重影响到育种者的积极性及新品种的及V)已将SSR标记用于新品种的DUS测试中。

近年来，国内外学者已在小麦、番茄、玉米、水稻及芝麻等多种作物中构建了DNA指纹数据库并用于品种的指纹分析(Roder et al., 2002; Bredemeijer et al., 2002; 施勇烽等, 2005; 盖树鹏等, 2011; 刘红艳等, 2012)，其中尤以水稻中的发展尤为突出。日前，国内学者已对我国的部分水稻骨干亲本、恢复系以及杂交水稻进行了该方面的探索(张媛媛等, 2010; 程保山等, 2007; 肖小余等, 2006; 陈英华等, 2009; 程本义等, 2007; 从夕汉等, 2010; 张彦等, 2006; 段世华等, 2002; 庄杰云等, 2006)，其中庄杰云等(2006)构建的103个水稻材料×24个标记的主栽水稻品种微卫星标记数据库最具代表性。 他们通过各个标记、各组材料的多态性表现，制定了NY/T 1433-2007 水稻品种鉴定DNA指纹方法。该套标记及标准基本满足了品种间初步鉴定的要求，但应用于近似种的品种鉴定以及真假种的鉴别，其引物和指纹库品种的数量以及技术体系等方面，还需要进一步的完善。

本研究利用前期构建指纹库的核心标记，对我国多年来研究生产中应用较为广泛的品种和本课题组育成的品种进行DNA指纹分析，以确定123份水稻品种的特异性，并通过分析品种遗传位点的纯合性以及随机配组的杂交组合的遗传稳定性情况，推导品种不稳定遗传的内因，从分子水平上为水稻育种、品种鉴定以及种子生产提供参考。

1结果与分析
1.1 SSR引物的扩增及品种鉴别
24对引物在123份水稻品种中共检测到138个等位位点，每对引物扩增的等位位点范围在3~10之间，平均值为5.75，其中RM5704、RM7288和RM3164等扩增的带型较多，而RM5389和NSSR1223仅扩增出3种带型。引物的PIC变幅为0.37~0.81，平均值为0.62。PIC值能较好的反应各标记的鉴别能力(表1)。
 

在138个等位位点中，有12个只存在一个品种，其中涉及到的引物及水稻品种分别是RM583 (9311)、RM1359 (福恢964)、RM289 (长粒爪)、RM7193 (航1号)、RM3395 (恩恢99-64和Lemont)、RM6948 (中9 B)、RM3164 (恢9810和V20 B)及RM5704 (台中65和南京11)；另外还有21个能特异性的区分粳稻和籼稻类群品种的等位位点，这些特异等位位点的特征谱带将有助于识别和鉴定相应水稻品种。

1.2 123份水稻品种的特异性分析
利用24对引物得到的多态性标记，构建了123份水稻品种的DNA指纹图谱库。通过计算这123份品种间的遗传相似系数，并将其结果进行了归纳整理，得到各品种间遗传相似系数平均值的变幅为0.71~0.82，最小值的变幅为0.64~0.70，最大值的变幅为0.80~0.96。由此可见，这123份品种间具有较高的平均遗传相似系数，但各品种间有较明显的特异性。参照NY/T 1433-2007 水稻品种鉴定DNA指纹方法，以不大于1个引物的差异为鉴定近似种、少于2个标记的差异定为不同品种的标准,本研究将相似系数为95%作为区别不同品种的标准。在此标准下，123份材料中有5对近似品种(表2)，其它的113份品种可划分为不同品种。
 

聚类分析表明，123份品种大体被分为2大类群，类群Ⅰ为籼稻类群。设相似系数0.782的阀值，类群Ⅰ可进一步分为不育系/保持系亚群、恢复系亚群和常规稻亚群。不育系/保持系亚群包括31份三系不育系/保持系和16份常规稻及三系恢复系。该亚群中包含部分的常规稻及恢复系品种，这可能与它们间有一定血缘关系相关，如其中的陆财号、广陆矮4号、南特号和矮脚南特等品种，是中国的矮秆早稻品种的衍生源(Sundaram et al., 2008)。亚群2包括55份恢复系及2份保持系(IR688998B和广占63S)。该亚群形成了以早恢89、明恢63、桂99和密阳46等4个恢复系为代表的类型。常规稻亚群是由特青为代表的桂朝2号、中恢413、台中在来1号和黑竹粳等5个品种在相似系数为0.80阀值处组成。恩恢99~ 64是类群Ⅰ的一个单基因型品种。类群Ⅱ为粳稻类群，该类群在相似系数0.79阀值处与类群Ⅰ区分开来，其中13个品种的遗传相似性反映了不同地理纬度的关系。

123份品种在相似系数0.958处被完全区分开来，同一育种单位或相关单位育成的品种优先聚在一起，这也说明了这些品种具有相似的遗传基础(图1)。
 

1.3品种的遗传稳定性分析
通过对123份水稻品种的SSR指纹标记的分析表明，有6份材料含有杂合的位点，表明有不稳定遗传的位点存在于这些材料中(表3)。稳定性测验中共得到16个杂交组合(图2)，测验结果表明，16份杂交稻中含有1~3个不精确遗传的位点，在这些不精确遗传的位点中，RM289出现了7次。RM7492、RM6487和RM583出现了2到3次。通过将这4个位点与前面的杂合位点进行比较，发现它们也出现在6份含有杂合位点的品种中(表4)，表明在这123份水稻品种中，不精确遗传的位点多数具有一定的重演性。

2讨论
自新中国成立以来，我国育成了5 200多份水稻品种，而且随着近年来新品种的逐渐增多及其多数品种遗传基础的不断变窄，传统的DUS鉴定方法已难以鉴别。DNA指纹标记用于品种鉴定的研究已有很多报道(应杰政等, 2006; 2007)，前人的研究结果表明指纹标记用于品种间的特异性分析方面具有强大的功能(肖小余等, 2006; 程本义等, 2007; 李红宇等, 2009; 华蕾等, 2007)，但对于品种的一致性、稳定性鉴定方面还不够完善，因此，我国的NY/T 1433-2007水稻品种鉴定DNA指纹方法还只是停留在试验研究阶段，并未在应用中发挥其应有的作用。

本研究在前人研究的基础上对123份材料进行了DNA指纹分析，试验中安排了部分与庄杰云等(2006)报导的同样引物及水稻品种，以确保与其研究结果有一定的一致性。本研究的特异性鉴定中发现123份水稻品种间有较高的平均遗传相似系数，这与前人认为我国的当前水稻品种遗传基础较为狭窄的结果较为一致(张晓丽等, 2008; 魏兴华等, 2009; 周坤炉, 1994)。本研究中聚类分群的结果与传统系谱对水稻的划分情况基本一致，说明这些指纹标记具有较高的代表性。

特异性划分标准是品种特异性鉴定的核心问题。国际上通常利用遗传距离作为划分品种特异性的标准，之前提出的有将0.10、0.20和0.25作为遗传距离临界值标准(Troyer and Rocheford, 2002)。国内的方法基本是采用比较具有差异的引物数。农业行业标准水稻品种鉴定DNA指纹方法NY/T 1433-2007规定，在品种间检测24对SSR核心引物，差异的引物对≥2个判定为不同品种，=1为近似品种，=0为相同品种或极近似品种，并建议≤1时，需增加其它方法佐证。目前可将两个指纹库的核心标记结合起来以判定两品种差异引物≤1的情况，通过加大鉴定引物的数量，达到减小误判的概率，从而给予更精准的判定。

稳定性是品种鉴定及其生产应用的必要条件。前人在利用微卫星标记对杂交稻组合与其亲本的匹配性试验中，发现很多有组合与其亲本不完全匹配的情况，他们一般都考虑到可能是亲本不完全纯合导致的剩余遗传效应所致。本研究在6个品种中的杂合位点及16个组合中发现有4个位点有多次出现类似的情况，与应杰云等(2006)文章中的杂交稻与其亲本不匹配的情况类似，在该文涉及到的不匹配的标记中，RM17、RM18、RM311和RM336等标记都出现较高的频率。因此，我们认为这种不稳定遗传的情况是广泛存在的，并且是品种不稳定遗传的主要因素之一。

杂交育种成败的关键取决于配组的亲本，适当加大育种亲本间的遗传差异，有利于选育出优势的后代。因此，本研究对品种间特异性划分的结果可为杂交配组亲本的选择提供一定的参考。本指纹库的核心标记，可结合与NY/T 1433-2007中推荐的标记鉴别品种，对于两库中遗传不稳定的标记，尽量不用于品种一致性、稳定性的研究，借此以更加真实有效的提高品种的鉴定水平。在品种间检测24对SSR核心引物，差异的引物对≥2个判定为不同品种，=1为近似品种，=0为相同品种或极近似品种，并建议≤1时，需增加其它方法佐证。目前可将两个指纹库的核心标记结合起来以判定两品种差异引物≤1的情况，通过加大鉴定引物的数量，达到减小误判的概率，从而给予更精准的判定。

稳定性是品种鉴定及其生产应用的必要条件。前人在利用微卫星标记对杂交稻组合与其亲本的匹配性试验中，发现很多有组合与其亲本不完全匹配的情况，他们一般都考虑到可能是亲本不完全纯合导致的剩余遗传效应所致。本研究在6个品种中的杂合位点及16个组合中发现有4个位点有多次出现类似的情况，与应杰云等(2006)文章中的杂交稻与其亲本不匹配的情况类似，在该文涉及到的不匹配的标记中，RM17、RM18、RM311和RM336等标记都出现较高的频率。因此，我们认为这种不稳定遗传的情况是广泛存在的，并且是品种不稳定遗传的主要因素之一。

杂交育种成败的关键取决于配组的亲本，适当加大育种亲本间的遗传差异，有利于选育出优势的后代。因此，本研究对品种间特异性划分的结果可为杂交配组亲本的选择提供一定的参考。本指纹库的核心标记，可结合与NY/T 1433-2007中推荐的标记鉴别品种，对于两库中遗传不稳定的标记，尽量不用于品种一致性、稳定性的研究，借此以更加真实有效的提高品种的鉴定水平。

3材料与方法
3.1水稻材料
根据本课题组长期的征集积累，共选出123份具有代表性的常规水稻品种和杂交稻组合亲本，其中常规品种和恢复系78个，胞质雄性不育系/保持系31个，光(温)敏核不育系1个，粳稻品种13个。从三系恢复系及不育系中选出10份恢复系和7份不育系，按不完全双列杂交随机配组，用于稳定性测验。

3.2指纹检测
选择分布于水稻12条染色体的24个多态性高、带型清晰且重复性好的SSR标记(每条染色体2个)，采用CTAB方法提取DNA (Murray and Thompson, 1980)。SSR引物的筛选、PCR扩增、多态性检测及数据校正参见本课题组前期发表的论文(颜静宛等, 2011)。

3.3数据分析
SSR引物的鉴定能力可用多态性信息量PIC值(Polymorphic information content)表示，其计算公式为：PIC=1-∑fi² (式中i为具有第i种带型的材料数)。同时，应用软件NTSYS-pc以共有DNA 片段比例(软件中参数为DICE)作为指标，计算供试各对材料间的相似系数。然后用非加权平均数UPGMA 方法(Unweighted pair group method using arithmetic averages)进行聚类分析。

分析123份材料各等位位点及其所在标记的纯合性。利用24对核心标记对杂交组合及其父母本的带型进行稳定性遗传测验。

作者贡献
田大刚设计、执行实验研究，并完成数据分析及论文初稿的写作；林艳和苏军等参与实验设计、执行。王锋是项目负责人，指导实验设计、实验执行、结果分析及论文修改；全体作者阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家转基因重大专项(2011ZX08001-001)、福建省自然科学基金杰出青年基金项目(2011J06009)和福建省农业科学院引进海外人才科研启动基金项目(HWRC- 2011-01)共同资助。

参考文献
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