研究报告/Research Report
马铃薯miR159的克隆及人工表达载体构建/Cloning and Construction of Artificial Expression Vector of Potato MiR159 
刘雪1,2 
,
杨江伟1,2 ,
唐勋1,2 ,
张宁1,2 ,
文义凯1,2 ,
周香艳1,2 ,
司怀军1,2* 
,
杨江伟1,2 ,
唐勋1,2 ,
张宁1,2 ,
文义凯1,2 ,
周香艳1,2 ,
司怀军1,2*
1甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室, 甘肃省干旱生境作物学省部共建国家重点实验室培育基地, 兰州, 730070;
2甘肃农业大学生命科学技术学院, 兰州, 730070
作者 通讯作者
《分子植物育种》印刷版, 2016 年, 第 14 卷, 第 9 篇
收稿日期: 2016年04月15日 接受日期: 2016年05月06日
2甘肃农业大学生命科学技术学院, 兰州, 730070
作者 通讯作者
《分子植物育种》印刷版, 2016 年, 第 14 卷, 第 9 篇
收稿日期: 2016年04月15日 接受日期: 2016年05月06日
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摘要
MicroRNAs (miRNAs)是一类非编码小分子RNA，是体内重要的内源性基因调节因子，主要是在转录后水平调控靶基因的表达。本研究是通过人工microRNA技术(artificial microRNA, 简称amiRNA)，与PCR技术克隆得到了701 bp的miR 159片段，然后将获得的miR 159片段通过双酶切后链接到植物表达载体pCPB 121，构建了马铃薯amiR 159表达载体。经PCR和酶切分析鉴定，确认载体构建成功。为后期通过马铃薯的遗传转化研究miR 159 / MYB的调控模式提供了帮助。
MicroRNAs (miRNAs) is a kind of non-coding small molecule RNAs, which is an important endogenous gene regulation factor and plays an important regulatory roles on negatively affecting gene expression at post-transcriptional level. In this study a 701 bp fragment of miR 159 was cloned by artificial miRNA and PCR technology. The expressional vector of amiR 159 was constructed with this fragment (701 bp) of miR 159 by double digestion ligated into the plant expression vector pCPB 121. Both PCR and restriction endonuclease digestion confirmed that the vector was successfully constructed. These findings could be helpful for searching on the regulation mode of miR159/MYB through the genetic transformation of potato.
关键词
马铃薯；MiR159；MYB转录因子；人工microRNA技术/Potato；MiR159；MYB transcription factor；MicroRNA
MicroRNAs（miRNAs）是一类重要的非编码单链小分子RNA，通常在转录后调节水平上介导mRNA靶分子的切割或抑制靶分子的翻译来调控其基因的表达(Voinnet et al., 2009)。自1993年，Lee等第一个在秀丽隐杆线虫虫(Caenorhabditis elegans L.)中发现一个22 bp的miRNA - Lin - 4，此后越来越多的miRNA被分离发现。自从20世纪90年代初，研究人员首次在植物中发现了RNA沉默现象(Matzke et al., 1989)，从此miRNA越来越多的被人们所熟知并应用。
人工microRNA技术一般均是通过植物体内原有的microRNA进行基因沉默调控生长发育的系统，它是以拟南芥(Arabidopsis thaliana) miR 319 a的前体作为表达amiRNA 的骨架序列，通过在线网站设计合适的引物，经重叠PCR扩增，将天然miR 319 a的成熟序列替换成目的miRNA的成熟序列，并构建表达载体后遗传转化导入植物体内来研究miRNA功能的一种方法。miRNA不编码蛋白质，主要以诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC)的形式对靶基因mRNA造成降解或者翻译抑制而行使其功能。该技术首次由Alvarez (Niu et al., 2006)、Niu和Schwab (Schwab et al., 2006)完成。现在人工microRNA技术已被成功的用于拟南芥(arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum L)、水稻(Oryza sativa)、小立碗藓(physcomitrella patens)等多个物种miRNA的功能研究中(Jin et al., 2014)。
MiR 159则普遍存在各种植物中，研究发现miR 159家族成员包括miR 159 a、miR 159 b、miR 159 c，其主要靶向调控MYB基因(覃成等, 2011)。在拟南芥中，miR 159作用于20多个靶基因，9个属于MYB基因家族，其中7个类似于GAMYB蛋白；水稻中3个编码类似GAMYB转录因子。研究证实，在植物中miR 159受赤霉素(GA)调节，作用于靶基因GAMYB，从而调节短日照植物开花时间和花药发育(Millar et al., 2005)。同时发现植物中miR 159还受脱落酸(ABA)诱导表达发上调，通过作用于两个MYB转录因子基因MYB 33和MYB 101在种子的萌发过程中起作用(Reyes and Chua, 2007)。在拟南芥和水稻中，miR 159过表达会特异性降低MYB 33、MYB 65的mRNA水平而导致雄性不育(Achard et al., 2004)。2010年，Patade等(2010)发现在高盐和干旱胁迫下，甘蔗叶片中miR 159表达发生明显变化(Palatnik et al., 2004)。2014年，研究发现在马铃薯(Solanum tuberosum, potato)中miR 159在干旱胁迫下针对性的作用于MYB转录因子(Yang J et al., 2014)。
本研究基于miR 159 / MYB类转录因子调控模式的保守性，通过利用人工miRNA 技术构建了马铃薯amiR 159表达载体，后期将其转化导入马铃薯中来研miR 159 / MYB的调控模式，为进一步通过马铃薯的遗传转化来研究miR 159 / MYB的调控模式提供了帮助。
1结果与分析
1.1 MiR 159引物的合成
本研究根据马铃薯miRNA 159成熟序列，通过在线软件WMD 3 (http://wmd3.weigel world.org/)设计了马铃薯miRNA159的人工miRNA引物(表1)。
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表1 构建马铃薯amiRNA 159表达载体的引物
Table 1 Primers for construction of amiRNA 159 expression vector
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1.2马铃薯miR 159的克隆
以pRS 300质粒为模板通过重叠PCR反应分别扩增得到272 bp的a片段(5'臂)、171 bp 的b片段(中心环)和298 bp的c片段(3'臂)。将经过2%琼脂糖凝胶纯化后的a、b、c片段(图1)等量混合为模板，经过PCR扩增得到701 bp的d片段(图2; 图3)。
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图3 d片段的测序
注: 下划线代表原pRS 300载体上miR319a的成熟序列和其反向序列; 红色区域代表经PCR扩增后替换的马铃薯miR 159成熟序列和其反向序列。
Figure 3 Sequencing of the D fragment
Note: The underline on the carrier on behalf of the original pRS 300 miR 319 a mature sequence and its reverse sequence. The red areas after PCR amplification to replace potato miR 159 a mature sequence and the reverse sequenc
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1.3 MiR 159双酶切
克隆载体pT - amiR 159和表达载体pCPB 121分别用限制性内切酶Kpn I和Sac I双酶切，分别切胶回收后得到512 bp的小片段(图4)和12000 bp左右的大片段，用于构建重组载体。
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图4 pT - amiR 159双酶切电泳
注: M: 2000 bpDNA分子量标准; 1: pT - miR 159酶切片段
Figure 4 Electrophoresis result of double enzyme digestion of pT - amiR 159
Note: M: DL 2000 DNA marker; 1: enzyme digestion fragment of pT - amiR 159
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1.4马铃薯amiR 159表达载体的构建
分别用Kpn I和Sac I双酶切载体pCPBI 121和amiRNAs前体，回收酶切后的目的片段并进行连接构建pCPBI 121 - amiR 167表达载体。表达载体pCPBI 121 - amiR 159双酶切结果在512 bp处有目的条带(图5)。
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图5 表达载体pCPBI 121 - amiR 159双酶切鉴定
注: M1: 2000 bp DNA分子量标准; l: 表达载体双酶切产物; M2: 15000 bp DNA分子量标准
Figure 5 Identification of double enzyme digestion of expression vector pCPBI 121 - amiR 159
Note: M1: DL 2000 DNA marker; 1: digestion products of expression vector with double enzyme; M2: DL 15000 DNA marker
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2讨论
MYB类转录因子家族是一类大的、多功能的转录因子，通常含有MYB结构域的转录因子，该结构域一般含有多个保守的间隔序列和氨基酸残基，并且均含有长度约51-52个氨基酸的多肽段。它根据自身的MYB结构域可以分为四类：MYB 1 R、R 2 R 3 - MYB、R 1 R 2 R 3 MYB (MYB 3 R)和4 RMYB。MYB Ifs是植物的转录因子基因家族主要家族，其主要参与植物体内的苯丙烷类次生代谢的调控途径，而苯丙烷类代谢则属于植物体内3条主要的次生代谢调控途径之一，它主要参与植物体色素合成的相关相关调节。近几年中，人们通过生化和遗传学方面对玉米(Zea mays)、金鱼草(Antirrhinum majus L.)、欧芹(Apium)和矮牵牛(Petunia hybrida)中黄酮类次生代谢的分支途径进行研究，发现MYB类转录因子家族中的R 2 R 3 - MYB转录因子在苯丙烷类次生代谢途径中的起主要的调节作用(莫晓婷等, 2013)。而在植物中, 植物应激胁迫的主要特征之一就是类黄酮等物质的积累，类黄酮物质在植物能防止辐射对植物的伤害，增强植物耐受性, 抗虫害等重要的功能(刘蕾等, 2008)。而在逆境条件的胁迫下不同的植物耐受性各有不同，这与植物体内的类黄酮等物质的含量、结构和类别等有密切关系。其MYB转录因子现已被广泛证实参与了类黄酮次生代谢途径的调控，如拟南芥中AtMYB 2和AtMYB 60参与植物的耐旱胁迫过程（Hoeren et al., 1998; Cominelli et al., 2005); MYB 68参与高温应答反应 (Feng et al., 2004)；在拟南芥、水稻和苹果树中R 2 R 3 - MYB转录因子过表达后能增强转基因植株对不同逆境胁迫条件下的抗性能力(Vannini et al., 2004; Pasquali et al., 2008; Soltesz et al., 2012)。已有研究表明miR 159 / MYB的调控模式在多种植物中保守并参与调控植物的形态建成，生长发育和对逆境胁迫的响应，但这些研究主要集中在拟南芥、水稻等模式植物中。马铃薯是世界范围内最重要的粮食作物之一，但对马铃薯miR 159 / MYB的调控模式还没有被完全阐明。
MicroRNAs (miRNAs)是一类小的、非编码的、内源性分子RNA，它通过影响转录后的基因表达在植物的应激反应中起着重要的负调控作用(Baulcombe et al., 2002)。研究显示，许多miRNAs在植物的各种生物胁迫和非生物胁迫中起到扮演重要的角色，miR 159家族成员在MYB - like基因中起到重要的调控及监管作用并编码MYBTFs的R 2 R 3结构域。然而miR 159在马铃薯中知之甚少，因此为了解miR 159调控的GAMYB基因在马铃薯生长发育过程中起到的作用。本研究为了进一步研究马铃薯miR 159的功能，利用人工microRNA技术构建了马铃薯amiR 159表达载体，后期将通过对马铃薯的遗传转化来构建miR 159靶基因GAMYB的突变体来研究其作用。
3材料与方法
3.1试验材料
模板载体pRS 300抗性标记为氨苄青霉素(Amp)；表达载体pCPBI 121 (含CaMV 35 S启动子)抗性标记为卡那霉素(Kan)（甘肃农业大学作物遗传改良与种质创新实验室保存)。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株为DH 5 α购自北京全式金生物技术公司；pMD® 18 - T克隆载体购自TaKaRa公司，其抗性标记为Amp。
3.2工具酶和试剂
Total RNA Kit、T4 DNA Ligase、LA Taq酶、RNase和Knp I、Sac I限制性核酸内切酶、5 × PrimeScript® RT Master Mix、SYBR® Premix Ex TaqTM II (2 ×)和pMD®18 - T试剂盒购自TaKaRa公司；1.5 kb DNA marker、DL 2000 marker、Spin柱式DNA胶回收试剂盒等常规实验用品均购自Sangon Biotech有限公司；蛋白胨、酵母提取物购自OXOID公司；X - Gal、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自Solarbio公司；其他生化试剂均为国产分析纯。PCR引物合成，DNA测序均由上海生物工程有限公司完成。
3.3 miRNA的克隆与测序
通过重叠PCR技术，以质粒pRS 300 (图6)为模板，分别用引物I (stu - miR 159 - s)、II (stu - miR 159 - a)、III (stu - miR1 59 * s)和IV (stu - miR 159 * a)，用马铃薯miR 159的21个核苷酸替换质粒miR 319 a中原有的20个成熟序列。首先，以pRS 300载体为模板，在第一轮的PCR反应中扩增出了a片段（5'臂）、b片段（中心环）和c片段（3'臂）(图7)，反应条件均为：95℃ 预变性2 min，95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 40 s，35～40个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。用胶回收试剂盒将PCR产物a、b、c 片段回收纯化，等量混合作为第二轮PCR反应的模板，以A、B为引物进行PCR反应，获得701 bp的d片段(表2)；反应条件均为：95℃ 预变性2 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，40 个循环，72℃延伸7 min。然后用1%的琼脂糖凝胶电泳纯化片段d，按照pMD®18 - T载体试剂盒的操作过程，将回收到的d片段连接到pMD® 18 - T载体上，获得克隆载体。然后采用热激法将获得的克隆载体转化入大肠杆菌DH 5 α菌株，经过蓝白斑筛选、菌液PCR和双酶切鉴定，将阳性克隆载体菌液送去上海生物工程有限公司测序分析，测序正确的质粒命名为pT - amiR 159。
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图6 模板质粒pRS 300结构
Figure 6 Structure of the template plasmid pRS 300
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图7 amiRNA前体产生
Figure 7 Schematic diagram of the amiRNA precursor
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表2 产生amiRNA前体的标准反应体系
Table 2 Standard reaction system of amiRNA precursor
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3.4表达载体构建与农杆菌遗传转化
选择测序正确的质粒pT - amiR 159用限制性内切酶Knp I和Sac I双酶切，回收目的片段约512 bp长度的小片段；同时用Knp I和Sac I双酶切pCPBI 121质粒，回收大片段；将pT - amiR 159中的小片段与pCPBI 121质粒中回收的大片段按DNA摩尔比3:1混合，加入T 4 DNA连接酶1 μL, 2 × T 4 DNA ligase buffer 1 μL，无菌双蒸水补充体积到10 μL，样品混匀后瞬时离心10 s，然后将反应体系放置于PCR仪中在25℃条件下连接30 min。然后取10 μL连接产物利用热激法转入到感受态大肠杆菌DH 5 α中，并涂布在含Kan抗性的LB培养基的平板上进行阳性筛选。经菌液PCR、酶切、测序等一系列验证正确后将其命名为pCPBI 121 - amiR 159。然后将pCPBI 121 - amiR 159质粒采用冻融法转化农杆菌的感受态细胞中。
作者贡献
刘雪和杨江伟是本研究的实验设计和实验研究的执行人；杨江伟完成数据分析，论文的写作；唐勋、张宁、文义凯、周香艳参与实验设计，试验结果分析；司怀军是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金(31460370)，甘肃省高等学校基本科研业务费项目(2014)和甘肃农业大学“伏羲人才”计划项目(FXRC20130102)共同资助。
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