胡萝卜(Daucus carota L. var. sativa DC.)为伞形花科胡萝卜属的二年生草本植物，其肉质根营养丰富，富含葡萄糖、蔗糖、胡萝卜素以及钙、钾、磷等多种矿质元素。每100 g鲜重中含胡萝卜素1.67~12.1 mg，为番茄5~7倍(蒋光明, 1989, 中国农业出版社, pp.7-10)。胡萝卜还具有很高的药用价值，可以治疗肠胃不适、饱闷气胀、百日咳等症状(王久兴, 2009, 科学技术文献出版社, pp.24-28)。胡萝卜在世界各地分布普遍，中国南北方均有栽培，是一种重要的根菜类蔬菜。目前对胡萝卜栽培、育种及营养成分分析等方面的研究较多，分子标记方面研究相对较少(邱丰艳等, 2010)。

ISSR为Zietkiewicz等(1994)发明的显性标记。该分子标记技术建立在PCR技术基础之上，兼具SSR标记和RAPD标记的优点，稳定性好，多态性高，在亲缘关系分析、遗传图谱构建、基因定位、遗传多样性分析、品种鉴定、SSR引物开发等方面得到了广泛应用(金雪等, 2013; 宋廷宇等, 2012; 黄歆贤, 2011; 王述彬等, 2009; 嵇怡等, 2008; 马红勃等, 2008; 肖扬等, 2009)。

本研究利用L₁₆(4⁵)正交表，对ISSR-PCR反应体系的主要成分进行了优化，同时进行了不同循环次数试验，旨在获得适于胡萝卜的ISSR反应体系，为胡萝卜遗传多样性分析、基因定位等提供理论依据。

1结果与分析
1.1 DNA检测结果
提取的基因组DNA用荧光分光光度计检测，检测结果为：DNA浓度151.9 ng/μL，OD260和OD280的比值等于1.9。这说明利用天根新型基因组提取试剂盒所提取的DNA质量较高，能够满足ISSR反应的需要。

1.2 ISSR-PCR扩增结果
应用正交试验设计对胡萝卜基因组DNA进行PCR扩增(图1)，PCR扩增的结果是反应体系中Mg²⁺、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA共同作用的结果。由图1可见，在16个组合中除2、4、9组合没有谱带外，都有谱带产生。第1组合谱带少而弱，可能是引物和模板浓度过低所致。第5组合谱带不明显，可能是dNTP浓度过低所致。第7组合谱带少，可能是模板DNA用量过低所致。第11组合谱带少，不清晰，可能是引物浓度低所致，12组合谱带较好。第13、14组合谱带弥散，可能是Mg²⁺和Taq酶浓度过高所致。第15、16组合条带数量适中，但条带弱。第10组合条带数最多，但扩增效果不清晰。第8组合谱带少可能是Taq酶用量少所致。通过比较，第6组合扩增的谱带多而且多态性好，谱带清晰，是理想的组合。

图1 正交设计ISSR-PCR反应体系扩增结果 注: M: DL2000 plus DNA marker; 1~16: 处理编号1~16, 同表2 Figure 1 The result of ISSR-PCR by orthogonal design on amplification Note: M: DL2000 plus DNA marker; 1~16: The treatment number 1~16 as showed in table 2

PCR扩增结果受到多个因素综合影响，而最佳的组合应该是特异性谱带多态性高、谱带清晰、且谱带较稳定的组合。因此，本研究确定6号组合为最佳组合，即25 μL的PCR反应体系中含：1.5 mmol/L Mg²⁺，0.15 mmol/L dNTP，1.5 U Taq DNA聚合酶，0.2 μmol/L引物，50 ng模板DNA。

1.3循环次数对扩增结果的影响
应用试验设计的6号组合作为反应体系，进行了不同循环次数试验，分别为30次、35次和40次。扩增结果见图2。由图2中可以看出35次和40次循环时，条带清晰，且循环结果差异不明显，故选择35次作为最佳的循环次数。

图2 循环次数对扩增结果的影响 注: M: DL2000 DNA marker; 1~3: 循环次数分别为35, 30, 40 Figure 2 Effects of cycle number on amplification Note: M: DL2000 DNA marker; 1~3: The number of cycles are 35, 30, 40

2讨论
本研究采用正交设计，得到了适于胡萝卜ISSR-PCR反应的体系。此反应体系的扩增效果受Mg²⁺、dNTP、Taq酶、引物和DNA模板等综合因素影响。邱丰艳等(2010)应用单因素试验对影响胡萝卜ISSR-PCR扩增效果的因素进行了研究。但单因素试验需要扩增次数多，较为繁琐，且单因素试验不能同时考察因素间的交互作用，因此所需的试验时间长。而正交设计具有均衡分散、综合可比、效用明确的特性，其可伸缩性强(盖钧镒, 2000, 中国农业出版社, pp.286-287)，可以较少的处理研究多因素的互作效应，尽快找到最佳反应体系(吴春燕等, 2012)。

在PCR反应体系中，引物浓度对PCR扩增效果影响显著，浓度过低产物少，条带难分辨，浓度太高条带不清晰，容易导致非特异性扩增，而且会增加引物二聚体形成的机会(宋江华等, 2013)。本研究中，适宜的引物浓度为0.2 μmol/L。

模板DNA的用量对PCR扩增有显著影响，但其适宜浓度的变化范围较大，浓度过低，无扩增条带或条带不稳定，过高会使非特异性扩增产物增加，造成电泳条带呈弥散状(李雪等, 2013)。

Mg²⁺浓度显著影响PCR反应的扩增效率和特异性，主要有两个方面：一是Mg²⁺能够激活Taq酶的活性；二是影响模板和引物杂交体的退火和解链温度(杨金华等, 2013)，进而影响扩增的真实性和产物的特异性。

模板DNA是影响ISSR-PCR反应体系的一个重要因素，要求纯度要高。本研究中提取的模板DNA浓度151.9 ng/μL，OD260/OD280=1.9，质量高，能够满足ISSR-PCR的需要。同时模板DNA的量也影响反应效果，量过高，特异性降低，非特异性产物增加；模板量过低，无扩增产物或产物不稳定(曾亮等, 2012)。在ISSR-PCR反应体系中，Taq酶用量过少，扩增不能正常进行，过多会产生非特异性扩增，且增加成本。在本研究中，50 ng DNA是适宜的模板用量，25 μL体系中Taq酶用量为1.5 U扩增效果好。

此外，循环次数的多少也会影响扩增反应，因此要进行循环次数的摸索，本体系35次循环为宜。

邱丰艳等(2010)研究得到的最佳反应体系为：在25 μL的反应体系中含2.0 mmol/L Mg²⁺、0.2 mmol/L dNTP、1.5 U Taq DNA聚合酶、0.5 μmol/L引物、20 ng模板DNA。除Taq DNA聚合酶用量与本研究相同外，均与本研究所得结果不同。可能是由于所选用的试验方法不同、试验材料有差异、应用的仪器不同或所选用的试剂有差别等造成的。本研究结果可以为应用正交设计进行ISSR-PCR反应体系优化及采用ISSR分子标记进行胡萝卜亲缘关系分析、基因定位等提供理论依据。

3材料与方法
3.1供试材料
供试材料为胡萝卜幼叶，采于吉林农业大学园艺学院蔬菜基地。用于ISSR-PCR反应dNTP和Taq DNA聚合酶由TAKARA公司生产，基因组提取应用天根的新型植物基因组提取试剂盒。引物为哥伦比亚大学设计的811，序列为(GA)8C，由上海生工合成。琼脂糖为天根公司产品，Marker购自索莱宝公司。

3.2方法
3.2.1胡萝卜基因组DNA的提取和浓度测定
基因组提取应用天根的新型植物基因组提取试剂盒，采用比色法测定提取的基因组DNA的浓度和纯度，并将浓度稀释为5 ng/μL，备用。

3.2.2反应体系的优化
选择L₁₆(4⁵)正交表，对PCR体系各反应成分因素(Mg²⁺, dNTP, Taq DNA聚合酶, 引物, 模板DNA)水平及正交试验表见表1和表2。反应体系中总体积为25 μL。

表1 ISSR-PCR体系因素-水平 Table 1 ISSR-PCRfactors-levels

表2 ISSR-PCR正交试验设计(L16(45)) Table 2 ISSR-PCR orthogonal design (L16(45))

PCR扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，35个循环；72℃ 10 min；4℃保存。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶在电泳仪上检测，120 V电泳1 h，在自动凝胶成像系统上拍照分析。根据分析结果，找到最佳反应条件，并进行30次、35次、40次循环反应，找到最佳反应次数。

作者贡献
吴春燕、宋廷宇和李静是本研究的实验设计和实验研究的执行人；吴春燕及李静完成数据分析，论文初稿的写作；陈赫楠参与了论文的校对工作；宋廷宇是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由吉林省财政厅科研育种专项资金项目(201104)资助。

参考文献
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