中国杂交籼稻种植面积占据全国杂交水稻总面积的90%以上，对粮食安全作出巨大贡献(闵捷等, 2011)。以前水稻育种过分追求高产而忽视米质的改良，导致现在育成和推广的优质籼稻品种少，且大部分品种米质较差，粒型、垩白度、垩白率等外观品质尤为突出(罗玉坤等, 2004; 闵捷等, 2011)。稻米品质差严重地影响了农民种粮效益、积极性以及稻米的市场竞争力。

水稻粒型与外观品质和产量密切相关，而且长粒型水稻还受到大多数消费者的偏爱，是一个非常重要的育种目标。水稻粒长属数量性状，易受环境因素影响。迄今为止，在已发现的102个水稻粒长QTL位点(http://www.gramene.org/db/qtl/)中，只有控制粒长的主效基因GS3被克隆。小粒品种中的GS3基因第2个外显子末端存在单碱基突变，导致GS3蛋白3’端的178个氨基酸缺失，从而使谷粒变长(Fan et al., 2006)。GS3基因存在于许多水稻品种中，是一个改良水稻外观品质和产量的重要基因(Tan et al., 2000; Kubo et al., 2001; Thomson et al., 2003; Fan et al., 2006)。然而，控制粒长主效基因GS3是短粒相对于长粒显性，在粒型改良的回交后代中均表现为短粒，无法对长粒性状进行选择。分子标记辅助选择技术能够在水稻任何生长阶段进行检测，准确鉴定杂合和纯合基因型，与常规育种相比具有准确、快速、高效的优势，已在直链淀粉和香味等水稻品质育种上取得良好的进展(刘巧泉等, 2006; 王岩等, 2009; 陈深广等, 2011)。因此，利用分子标记辅助选择改良水稻粒型具有重要意义。

Ⅱ-32A是目前中国应用面积最广及配组品种最多的不育系之一，其粒型偏短、外观品质差导致所配制组合的外观品质较差，影响其进一步推广应用。本研究以Ⅱ-32A的保持系Ⅱ-32B作为轮回亲本，常规稻佳辐占为优质供体亲本，利用选择回交导入方法和分子标记辅助选择技术，同时对主要农艺性状进行选择，改良Ⅱ-32A的保持系Ⅱ-32B的外观品质，对提高杂交籼稻稻米的外观品质具有重要的意义。

1结果与分析
1.1连锁标记在亲本间的多态性
利用与GS3基因紧密连锁的标记MRG5881和GS09对Ⅱ-32B、佳辐占进行多态性分析。结果表明，佳辐占扩增出的条带大小与对照明恢63一致，而Ⅱ-32B的条带大小与佳辐占不一样(图1)。说明MRG5881和GS09两个标记在Ⅱ-32B、佳辐占间呈现出很好的多态性，可以用于Ⅱ-32B外观品质的分子改良。

图1 BC2F2 部分单株的MRG5881 (A)和GS09 (B)标记检测 注: P1: Ⅱ-32B; P2: 佳辐占; MH: 明恢63; 1~10: BC2F2 部分单株 Figure 1 GS3 genotypes of partial plants detected by MRG5881 (A) and GS09 (B) markers in BC2F2  generation Note: P1: Ⅱ-32B; P2: Jiafuzhan; MH: Mingfui63; 1~10: Partial plants of BC2F2 generation

1.2分子标记辅助选择
从佳辐占和Ⅱ-32B的BC₁F₁开始，在秧苗期利用GS3基因的连锁标记MRG5881和GS09进行分析，在抽穗期选择具有GS3基因且农艺性状与Ⅱ-32B较相似的单株用于进一步回交、自交。在BC₁F₁群体筛选到6个GS3基因杂合型且农艺性状与轮回亲本较相似单株用于继续回交，获得BC₂F₁代种子。在BC₂F₁代群体中筛选GS3基因杂合型单株，再从中挑选到农艺性状与Ⅱ-32B基本相似的单株2株用于自交，以后每一个自交群体也进行基因型检测(图1)，筛选GS3基因纯合型单株，再从中选出农艺性状与轮回亲本较相似的单株用于自交，直至农艺性状稳定。最后，在BC₂F₄代群体筛选到GS3基因纯合、长粒型，而且农艺性状与Ⅱ-32B很相似的稳定纯合改良株系4个，分别命名为GL1、GL2、GL3和GL4。

1.3遗传背景分析
选取的206个SSR标记中只有46个标记在佳辐占和Ⅱ-32B间表现出遗传多态性，多态性比率为22.3%，说明了Ⅱ-32B与佳辐占的遗传差异性较小。这些标记在12条染色体上遗传差异性明显不同，其多态性比率在13.3%~55.6%之间。其中第5和7染色体上有多态性的标记最少，都只有2个标记，多态性比率均为13.3%；而第10染色体的多态性比率最高，为55.6% (表1)。

表1 用于遗传背景分析的标记 Table 1 Markers used for the analysis of genetic background

利用筛选出的46对多态性标记对获得的4个改良株系GL1、GL2、GL3和GL4进行遗传背景回复率分析。结果表明(表2)，4个改良株系在12条染色体上的平均背景回复率为93.5%，明显高于理论回复率87.5%；其中GL2最高为96.3%，GL3最低为90.7%。4个改良株系除在第5和第7染色体的背景回复率较低外，其余染色体的背景回复率达到或接近100.0%。第5和第7染色体平均背景回复率分别为62.5%和81.3%，这是因为Ⅱ-32B与佳辐占在这两条染色体上的遗传多态性低，都是15个标记中只有2个表现出多态性，仅占13.3%；其中，第5染色体有1个标记位点没有回复，导致总体遗传回复率偏低。在4个改良株系中，GL2改良株系的遗传背景回复率最高，而且分别只在第5和第6染色体上存在一个位点未回复。

表2 Ⅱ-32B改良株系的遗传背景分析 Table 2 Analysis of the genetic background for the improved lines of Ⅱ-32B

1.4 Ⅱ-32B改良株系的外观品质
从表3可看出，供体亲本佳辐占和轮回亲本Ⅱ- 32B的粒长、垩白率、垩白度差异很大。4个改良株系的谷粒长在8.83~9.06 mm之间，平均为8.99 mm，与改良前的Ⅱ-32B (8.04 mm)相比增长极显著。同时改良后的Ⅱ-32B粒宽平均值也由原来的3.02 mm缩小至2.85 mm，其长宽比则从2.67增至3.16。垩白率和垩白度的平均值分别由改良前的55.6%和14.3%极显著下降到改良后的23.9%和4.6%。研究结果表明，Ⅱ-32B改良株系的粒型明显变得细长，同时垩白率、垩白度极显著降低。

表3 Ⅱ-32B改良前后外观品质的比较 Table 3 Comparison of the appearance quality between the improved lines and their parents

1.5 Ⅱ-32B改良株系的主要农艺性状
对Ⅱ-32B和4个改良株系主要农艺性状进行统计分析，结果表明(表4)，在抽穗期、株高、有效穗、穗长、结实率等性状无显著差异。但是，4个改良株系的千粒重在26.42~27.30 g，平均为26.80 g，与轮回亲本Ⅱ-32B (25.20 g)相比，显著增加。

表4 Ⅱ-32B改良前后主要农艺性状比较 Table 4 Comparison in the main agronomic trains between the improved lines and their parents

2讨论
GS3基因是控制粒长的主效QTL，将该基因导入需要改良的品种中，可以大大改善品种的外观品质和提高产量，具有广阔的应用前景(Fan et al., 2006)。但目前利用该基因进行分子标记辅助选择改良水稻外观品质的报道较少，仅在常规稻华粳籼74有成功改良的报道(杨梯丰等, 2010)，对杂交稻亲本改良更少见报道。本研究采用选择回交导入法，利用与GS3紧密连锁的SSR和InDel标记先对回交群体进行基因型检测，再从中选择与轮回亲本的农艺性状基本相似的阳性单株进行回交、自交，经过2代回交和3代自交，获得4个改良株系，遗传背景回复率均超过90%，农艺性状除了与目的基因相关的千粒重外，其余5个主要农艺性状均不显著。其中，GL2株系的遗传背景回复率超过96%，明显高于理论值87.5%，但其谷粒明显变得细长，垩白率和垩白度也显著降低。本研究表明了利用选择回交导入法、分子标记辅助选择与表型选择相结合可较快速地改良杂交稻亲本Ⅱ-32B的外观品质并保留了轮回亲本Ⅱ-32B的优点。

选择与轮回亲本遗传差异较小的优质供体亲本，可提高分子标记辅助选择的效率。本研究选择在12条染色体分布较为均匀的206个SSR标记，平均每条染色体多达17个，但亲本间多态性标记仅有46个，多态性比例仅为22.3%。这可能是佳辐占也属于早籼品种，遗传组成与Ⅱ-32B比较相近的缘故。本研究的4个改良株系在206个位点分别只有2~4个位点带有供体亲本的带型，其中GL2只有2个位点表现供体亲本的带型，也就是GL2改良系与轮回亲本的遗传相似度超过99%。

水稻粒型影响了水稻的外观品质与产量，一直以来是水稻主要的育种目标之一。长粒型稻米受到了大多数消费者的追捧，而且长粒型籼稻品种的品质一般优于中粒型及短粒型品种(罗玉坤等, 2004)。杂交稻稻米外观品质主要受不育系谷粒长度的影响，这是因为杂交稻的谷粒长度主要是受短粒一方影响，而杂交稻恢复系一般是长粒型且外观品质比不育系好。本研究获得的GL2改良系，遗传背景回复率高，除了千粒重外，其它农艺性状与Ⅱ-32B基本一样，可作为重点株系进一步与Ⅱ-32A回交，培育优质的Ⅱ-32A，改良Ⅱ-32A的外观品质，可提高Ⅱ优系列组合的外观品质并保留Ⅱ优系列组合的优点，或作为亲本对Ⅱ-32B进一步多基因聚合的分子改良，进而延长Ⅱ-32A的使用年限和扩大Ⅱ优系列组合推广面积。

3材料与方法
3.1水稻材料
轮回亲本Ⅱ-32B是优良籼型三系不育系Ⅱ-32A的保持系，属短粒型，垩白率和垩白度高。供体亲本佳辐占是厦门大学生命科学院选育的优质常规稻品种，一级优质米，属长粒型，垩白率和垩白度低，达部颁一级标准(王侯聪等, 2011)。

3.2分子标记辅助选择方案
Ⅱ-32B与佳辐占杂交，并以Ⅱ-32B作为轮回亲本，回交2次自交3次。每个回交和自交群体都先进行分子标记辅助基因型选择，从中选择带有目的基因且农艺性状与Ⅱ-32B较相似的阳性单株继续回交或自交，直到BC2F4选择到农艺性状稳定、目的基因纯合的改良株系4个。

3.3分子标记分析
水稻幼嫩叶片DNA的提取采用CTAB抽提法(Doyle and Doyle, 1990)。与GS3紧密连锁的标记是SSR标记MRG5881和InDel标记GS09，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。PCR扩增采用10 μL反应体系：10×PCR Bufer (Mg²⁺) 1 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 0.4 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.25 μL，DNA (2 ng/μL) 3 μL，Taq (5 U/μL) 0.2 μL，灭菌超纯水4.9 μL。SSR标记反应参照赵明富等(2008)的程序进行。PCR扩增产物采用8.0%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，荧光核酸染料GeneFinder染色30 min后在Explorer 10凝胶成像系统成像，记录结果。

3.4遗传背景分析
选用12条染色体上分布相对均匀的206对SSR引物(Temnykh et al., 2001)对轮回亲本Ⅱ-32B和供体亲本佳辐占进行多态性分析，获得双亲间的多态性标记。然后用筛选到的多态性标记对BC₂F₄中挑选到的具有GS3基因且农艺性状与Ⅱ-32B基本相似的改良株系进行遗传背景分析。背景回复率采用Hospital等(1992)方法计算。

3.5主要农艺性状考查
水稻材料种植在福建省农业科学院水稻研究所福州试验基地。每个改良株系和亲本进行随机小区试验，设置3次重复，每个小区种植20个单株，选取中间的10株进行考种。调查抽穗期，成熟后考查株高、每株有效穗数、穗长、结实率、千粒重等主要农艺性状。

3.6外观品质考查
对Ⅱ-32B、佳辐占和BC₂F₄的4个改良株系进行粒型、垩白率、垩白度考查。成熟后每株取主穗，脱粒烘干之后，每株随机取成熟饱满种子10粒，每个株系测量5个单株，用游标卡尺测量谷粒的粒长、粒宽，并计算长宽比，取其平均值用于分析。

垩白率和垩白度参照中华人民共和国国家标准《GB/T 17891-1999优质稻谷》进行测量和计算(国家质量技术监督局, 1999, 中华人民共和国国家标准, 优质稻谷GB/T 17891-1999)。

作者贡献
方珊茹和吴春珠是本研究的实验设计和实验研究的执行人；方珊茹和刘玉芹完成数据分析，论文的写作；郑苹立、熊雪娇、沈伟锋、庄丽萍参与实验研究；赵明富是项目的负责人，指导实验设计，数据分析，论文的修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由福建省自然基金重点项目(B0420002)和福建省农业科学院创新团队(CXTD-1-1301)共同资助。

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