Rho族蛋白是小G蛋白家族成员之一，是肌动蛋白细胞骨架重组的主要调节因子之一，在协调细胞极性化和正常的形态发育过程中起重要作用(Verhey and Gaertig, 2007; Akhmanova and Steinmetz, 2008)。Rho族蛋白在GTP活性态和GDP非活性态之间循环，发挥信号传导的分子开关作用，但其本身内在的GTP酶活性很低，其活性的动态平衡受Rho GEF、Rho GAP和Rho GDI三种调控因子的影响。其中，Rho GEF催化Rho族蛋白从无活性GDP结合状态向有活性的GTP结合状态转换，是正调控因子；Rho GAP催化Rho族蛋白从有活性GTP结合状态向无活性的GDP结合状态转换，是负调控因子；而Rho GDI也是负调控因子，其维持Rho族蛋白的GDP状态(Vigil et al., 2010; Mittnacht et al., 1997)。

Rho GAP家族成员在各种真核生物中普遍存在。所有Rho GAP蛋白均有一个保守的GAP结构域，此结构域中保守的精氨酸是与Rho族蛋白活性位点互作的关键区域，它插入Rho GTP酶的活性部位，激活Rho蛋白的GTP酶活性。Rho GAP活性的调控机制存在多元化，包括脂质结合、蛋白互作、磷酸化和蛋白酶解等(Gong et al., 2013)。本研究的目标基因MGG_09303是稻瘟病菌中一个假定Rho GAP，包含一个位于N端保守的GAP结构域和保守的精氨酸结构，并与酵母中的BEM2同源性高达47%。因此我们推论，它可能作为GAP发挥重要的生化调控作用。

水稻(Oryza sativa)是人们的主要粮食作物，由稻瘟病菌引起的稻瘟病是危害水稻最严重的三大病害之一，严重影响着稻米的产量和品质，进而影响人们的生活品质(Tcherkezian and Lamarche-Vane, 2007)。稻瘟病菌作为研究真菌和植物的重要模式生物，其侵染循环包括稻瘟病菌分生孢子的产生和萌发、芽管的极性生长、附着胞的分化、侵入栓的形成以及在组织内侵染性生长，该侵染过程是一个涉及复杂的细胞分化、信号传导和极性生长的过程(Ou, 1980)。在丝状真菌中，Rho族蛋白作为分子开关是极性生长与细胞骨架重组过程中的关键调控因子，因而Rho族蛋白可能与稻瘟病菌生长发育及致病过程直接相关。研究证实Rho族蛋白Rac1、Cdc42和Rho3在稻瘟病菌孢子形态建成、附着胞分化以及侵染性生长过程中均起着重要作用(Chen et al., 2008; Zheng et al., 2007; 2009)。陈继圣等研究发现稻瘟病菌Rac1-CA突变和Rac1-DN突变对于稻瘟病菌的产孢和致病性是必需的(Chen et al., 2008; Talbot, 1995)。郑武等研究发现稻瘟病菌Cdc42-CA、Cd-c42-DN、Rho3-CA和Rho3-DN对稻瘟病菌的生长发育和致病性也是必需的(Chen et al., 2008; Zheng et al., 2007; 2009)。

目前酵母中对Rho GAPs与Rho的关系研究报道较多(Barthe et al., 1998; Roumanie et al., 2000; Gong et al., 2013)，但在丝状真菌中关于Rho GAPs与Rho的互作关系，目前报道还很少。本文构建了酵母双杂的捕获载体pGADT7-MGG_09303，分别与本实验室保存的Rho族蛋白的持续激活态(CA)和持续失活态(DN)诱饵载体共转酵母细胞，通过酵母双杂交X-Gal显色来鉴定与MGG_09303互作的Rho族蛋白，为进一步阐明其调控Rho GTP酶信号传导的机理提供理论参考依据。

1结果与分析
1.1稻瘟病菌MGG_09303与酵母中的同源蛋白序列比对结果
用NCBI中的BLAST，基因MGG_09303分别与酿酒酵母中的RhoGAPs蛋白进行两两比对，基因MGG_09303与酵母中RhoGAPs蛋白进行一致性和多序列比对，氨基酸一致性和相似性比对的结果是，一致性较高的有为BEM3 (29%)、RGD1 (28%)、BEM2 (28%)、LRG1 (27%)，而相似性较高的有RGD2 (53%)、LRG1 (52%)。分析前人研究结果可知，在酵母中BEM3的互作蛋白有Rho1和Cdc42 (Zheng et al., 1994)；RGD1的互作蛋白Rho3和Rho4 (Barthe et al., 1998; Roumanie et al., 2000)；BEM2的互作蛋白有Rho1、Rho2、Rho4和CDC42 (Gong et al., 2013)；LRG1的互作蛋白有Rho1 (Lorberg et al., 2001)。本研究推测MGG_09303有可能与Rho1和Rho3互作。利用MEGA 5.1软件中的Clustal W将MGG_09303与酵母中的同源蛋白进行多序列比对分析，同时利用在线网站(http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi/)进行序列着色。通过序列比对可以看出，MGG_ 09303与酿酒酵母中的RhoGAP具有相同的保守氨基酸-精氨酸(图1)。点突变已证明RhoGAP结构域中的精氨酸是是与Rho族蛋白活性位点互作的关键区域(Schaefer et al., 2011)。酵母双杂交实验结果证实，稻瘟病菌中的MGG_09303与Rho1-CA和Rho3-CA互作，初步验证了预测的结果。

图1 稻瘟病菌MGG_09303与酿酒酵母中RhoGAP蛋白多序列比对 注: 稻瘟病菌MGG_09303与酿酒酵母中RhoGAP蛋白都含有3个保守的区域, 其中Block1的精氨酸(Arg483)是与Rho族蛋白活性位点互作的关键区域 Figure 1 Sequence alignment of MGG_9303 and RhoGAPs in Saccharomyces cerevisiae Note: Three conserved blocks are labeled on top, the conserved arginine residue corresponding to Arg483, a key catalytic residue of RhoGAPs is indicated by an arrowhead

1.2 RNA的质量检测
采用TRizol试剂提取稻瘟病菌野生型Guy11菌丝体总RNA，根据所测吸光光度值计算出RNA的实际浓度，取总量>100 ng的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，检验RNA质量。从图2A可知，稻瘟病菌Guy11菌丝体的总RNA样品较完整，28S rRNA和18S rRNA条带清晰可见。用紫外分光光度计测定RNA纯度，OD260/OD280的值在2.0以上，纯度较好，可用于后续的研究。

图2 RNA质量和Rho-BD自激活检测 注: A: 总RNA质量检测; B: Rho-BD自激活检测; 1: 阳性; 2: 阴性; 3: MoRho1-CA; 4: MoRho2-CA; 5: MoRho3-CA; 6: MoRho4-CA; 7: MoRac1-CA; 8: MoCdc42-CA Figure 2 Detection of total RNA by electrophoresis and the identification of self-activation of Rho-BD Note: A: Total RNA; B: The identification of self-activation of Rho-BD; 1: Positive control; 2: Negative; 3: MoRho1-CA; 4: MoRho2-CA; 5: MoRho3-CA; 6: MoRho4-CA; 7: MoRac1-CA; 8: MoCdc42-CA

1.3 MGG_09303 ORF扩增和酵母双杂交AD载体的构建
PCR产物与AD载体连接后转入大肠杆菌DH-5α感受态细胞中，阳性重组子经NdeⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，结果显示插入片段的大小与预期大小一致，命名为pGADT7-MGG_09303 (图3A)。测序结果正确且阅读框架无移码。

图3 pGADT7-MGG_09303载体的双酶切验证和X-gal显色验证 注: A: pGADT7-MGG_09303载体的双酶切验证; B: X-gal显色验证; 1: 阳性; 2: 阴性; 3: Rho1-CA; 4: Rho1-DN; 5: Rho3-CA; 6: Rho3-DN; 7: Rac1-CA; 8: Rac1-DN Figure 3 Digestion of MGG_09303-AD vector and the results of X-α-Gal staining Note: A: Digestion of MGG_09303-AD vector by NdeⅠ and BamHⅠ; B: The results of X-α-Gal staining; 1: Positive control; 2: Negative control; 3: Rho1-CA; 4: Rho1-DN; 5: Rho3-CA; 6: Rho3-DN; 7: Rac1-CA; 8: Rac1-DN

1.4 Rho-BD载体的自激活检测
挑取含有诱饵质粒BD-MoRho-CA的酵母菌落，分别划线接种于SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/-His/ X-α-Gal和SD/-Trp/-Ade/X-α-Gal三种缺陷培养基上，30℃培养3~5 d，观察各菌落的生长及显色情况。结果发表，含有诱饵质粒pBD-MoRho-CA的酵母菌只能在SD/-Trp/X-α-Gal培养基上生长且菌落为白色，而阳性对照在SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/-His/X-α-Gal和SD/-Trp/-Ade/X-α-Gal培养基上均能生长且菌落显蓝色(图2B)，以上结果表明酵母菌AH109内的BD-MoRho-CA融合蛋白无自激活活性，可用于后续研究。

1.5酵母体内相互作用验证
将构建的pGADT7-MGG_09303载体分别与Rho-BD载体的CA和DN共转到酵母菌株AH109的感受态细胞，涂于SD-leu-Trp培养基上，3 d后挑取转化子，转涂于SD-Leu-Trp-His-Ade培养基上。随机挑取一个转化子划线于涂有X-gal的SD-leu-Trp培养基和SD-leu-Trp-His-Ade培养基上，观察其显色情况。结果显示，MGG_09303/Rho1-CA、MGG_ 09- 30-3/Rho3-CA和阳性对照组显蓝(图3B)，表明MGG_09303可能是Rho1和Rho3的GAP。

2讨论
Rho GAP作为分子开关，是负调控Rho GTP酶的主要调节因子之一，能极大地提高内源Rho GTP酶的活性，抑制其信号的传导。系统进化分析暗示M-GG_09303很可能编码一个保守的Rho GAP蛋白。稻瘟菌数据库中编码Rho族蛋白的基因有Rho1、R- ho2、Rho3、Rho4、Rho5、Rho6、Rac1和Cdc42。酵母双杂交结果表明，MGG_09303可以与Rho1和Rho3蛋白的持续激活态(CA)互作，不与其失活态(DN)互作，初步说明了它有可能是Rho1和Rho3的GAP。尽管MGG_09303基因敲除突变体与野生型相比表型差别不大，但由于Rho GAP调控Rho蛋白的分子机制是精细和复杂的，因此MGG_09303仍可能在Rho信号传导过程中发挥重要的角色。

Fields和Song (1989)创立酵母双杂交技术，为体内互作蛋白筛选提供了一种有效的途径。本研究利用酵母双杂交技术初步探讨了MGG_09303与Rho蛋白的互作关系。但这种技术本身存在着假阳性，因此我们将进一步通过GST Pull-down、GAP活性测定等技术验证MGG_09303是否真正为Rho1和Rho3的GAP。

3材料与方法
野生型稻瘟病菌株Guy11和Rho族蛋白激活态和失活态BD诱饵载体质粒来自本实验室保存，酵母双杂交系统购自Clontech公司；限制性内切酶购自厦门鹭荣公司；质粒提取试剂盒及DNA凝胶回收试剂盒购自天根公司；氨基酸购自Sigma公司。

3.1 MGG_09303与酵母中RhoGAP蛋白序列的比较
利用在线的NCBI中的BLASTP软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/)，分别获得MGG_09303与酵母中RhoGAPs蛋白氨基酸的一致性。

3.2稻瘟病菌模板cDNA的制备
将培养5 d后的固体酵母培养基上的稻瘟病菌野生型Guy11切成细小的菌丝块，转移至100 mL液体CM液体培养基中，28℃，180 rpm振荡培养3 d后，过滤收集菌丝备用，用标准的TRizol法提总RNA。
 两步法cDNA的合成采用Promega公司逆转录试剂盒，具体反应步骤和条件根据试剂盒的说明方法进行。

3.3 pGADT7-MGG_09303捕获载体的构建
根据稻瘟菌数据库中MGG_09303基因的ORF序列设计引物(F: 5’-GGAATTCCATATGATGGGACGCAAACCTGCAC-3’; R: 5’-CGCGGATCCCTAGAAGCCCAGTGGCGAC-3’)，以稻瘟病菌株野生型Guy11的cDNA为模板进行PCR。将PCR产物经回收纯化，用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切回收基因片段，与经同样双酶切的酵母AD载体pGADT7连接，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆测序。 测序正确的AD载体命名为pGADT7-MGG_09303。

3.4酵母感受态的制备
酵母AH109感受态的制备和转化，参照Clontech公司的酵母操作手册进行。

3.5酵母体内相互作用验证
将构建好的重组质粒pGADT7-MGG_09303分别与Rho1、Rho2、Rho3、Rho4、Rac1、Ccd42的持续激活态(CA)和持续失活态(DN)共转化酵母菌AH109感受态细胞，然后在SD/-Trp-Leu-His-Ade四缺培养基上显色，酵母双杂交参照Clontech酵母双杂交手册方法进行。

作者贡献
叶文雨是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成实验结果分析以及论文初稿的写作；陈四妙、陈晓、林艺娟、汪洋和余文英参与实验材料的准备、文献收集和整理工作；鲁国东参与实验设计、数据分析和论文的写作与修改；王宗华和陈继圣是项目的构思和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究得到国家自然科学基金(31030004; 31300132)资助。

参考文献
Akhmanova A., and Steinmetz M.O., 2008, Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 9(4): 309-322

Barthe C., de Bettignies G., Louvet O., Peypouquet M.F., Morel C., Doignon F., and Crouzet M., 1998, First characterization of the gene RGD1 in the yeast Saccharomyces cerevisiae, C. R. Acad. Sci. Ⅲ, 321(6): 453-462

Chen J., Zheng W., Zheng S., Zhang D., Sang W., Chen X., Li G., Lu G., and Wang Z., 2008, Rac1 is required for pathogenicity and Chm1-dependent conidiogenesis in rice fungal pathogen Magnaporthe grisea, PLoS Pathog., 4(11): e1000202

Fields S., and Song O., 1989, A novel genetic system to detect protein-protein interactions, Nature, 340(6230): 245-246

Gong T., Liao Y., He F., Yang Y., Yang D.D., Chen X.D., and Gao X.D., 2013, Control of polarized growth by the Rho family GTPase Rho4 in budding yeast: requirement of the N-terminal extension of Rho4 and regulation by the Rho GTPase-activating protein Bem2, Eukaryot. Cell, 12(2): 368-377

Lorberg A., Schmitz H.P., Jacoby J.J., and Heinisch J.J., 2001, Lrg1p functions as a putative GTPase-activating protein in the Pkc1p-mediated cell integrity pathway in Saccharomyces cerevisiae, Mol. Genet. Genomics, 266(3): 514-526

Mittnacht S., Paterson H., Olson M.F., and Marshall C.J., 1997, Ras signalling is required for inactivation of the tumour suppressor pRb cell-cycle control protein, Curr. Biol., 7(3): 219-221

Ou S.H., 1980, Pathogen variability and host resistance in rice blast disease, Annu. Rev. Phytopathol., 18: 167-187

Roumanie O., Peypouquet M.F., Bonneu M., Thoraval D., Doignon F., and Crouzet M., 2000, Evidence for the genetic interaction between the actin-binding protein Vrp1 and the RhoGAP Rgd1 mediated through Rho3p and Rho4p in Saccharomyces cerevisiae, Mol. Microbiol., 36(6): 1403-1414

Schaefer A., Höhner K., Berken A., and Wittinghofer A., 2011, The unique plant RhoGAPs are dimeric and contain a CRIB motif required for affinity and specificity towards cognate small G proteins, Biopolymers, 95(6): 420-433

Talbot N.J., 1995, Having a blast: Exploring the pathogenicity of Magnaporthe grisea, Trends Microbiol., 3(1): 9-16

Tcherkezian J., and Lamarche-Vane N., 2007, Current knowledge of the large RhoGAP family of proteins, Biol. Cell, 99(2): 67-86

Verhey K.J., and Gaertig J., 2007, The tubulin code, Cell Cycle, 6(17): 2152-2160

Vigil D., Cherfils J., Rossman K.L., and Der C.J., 2010, Ras superfamily GEFs and GAPs: validated and tractable targets for cancer therapy? Nat. Rev. Cancer, 10(12): 842-857

Zheng W., Chen J., Liu W., Zheng S., Zhou J., Lu G., and Wang Z., 2007, A Rho3 homolog is essential for appressorium development and pathogenicity of Magnaporthe grisea, Eukaryot Cell, 6(12): 2240-2250

Zheng W., Zhao Z., Chen J., Liu W., Ke H., Zhou J., Lu G., Darvill AG., Albersheim P., Wu S., and Wang Z., 2009, A Cdc42 ortholog is required for penetration and virulence of Magnaporthe grise, Fungal Genet. Biol., 46: 450-460

Zheng Y., Cerione R., and Bender A., 1994, Control of the yeast bud-site assembly GTPase Cdc42, catalysis of guanine nucleotide exchange by Cdc24 and stimulation of GTPase activity by Bem3, J. Biol. Chem., 269(4): 2369-2372