辣椒(Capsicum annuum)是中国重要的蔬菜作物之一，种质资源极为丰富，关于辣椒属种间和种内资源材料的遗传多样性和亲缘关系分析，国内外学者根据形态学、细胞学和分子标记技术已进行了一些研究。根据RFLP研究结果，Lefebvre等(1993)认为C. annuum中的辣型辣椒遗传多态性较高，甜椒材料遗传多态性则较低。Prince等(1995)采用RFLP技术对辣椒属5个种的21份材料进行了亲缘关系分析，发现C. annuum、C. frutescens和C. baccatum三者的种间关系较近。Paran等(1998)利用RAPD和AFLP标记检测了34个C. annuum材料的遗传多样性，发现小果形辣椒较大果形具有较高的遗传多样性。刘林娅等(2013)利用ISSR技术对黄灯笼辣椒种质资源的遗传多样性进行研究分析后发现，黄灯笼辣椒具有较高的遗传多态性。陈学军等(2012)发现SRAP和SSR标记在中国灌木辣椒(C. frutescens)中的多态性位点比率分别达到72.9%和98.17%，表明中国灌木辣椒遗传多样性很丰富。国内研究者先后利用RAPD或ISSR技术对C. annuum种5个变种辣椒资源的遗传多样性进行了分析，结果均表明C. annuum种内遗传差异较低(王玲等, 2003; 马艳青等, 2003; 张璐等, 2003; 孙凌云等, 2005; 陈学军等, 2006; 2007; 詹永发等, 2010; 李永平等, 2011)。

核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacers, ITS)是位于核糖体18S和26S之间转录间隔区的DNA片段，被5.8S分割成2段。由于其进化速度较快、相对长度较稳定等特点，已成为研究植物分类和亲缘关系的重要工具(Bellarosa et al., 2005; Kress et al., 2005)。张利等(2007)对11份仲彬草属物种的ITS区序列进行了系统发育分析，发现形态相似、地理分布一致的物种有聚在一起的倾向，ITS区序列分析结果与细胞学、形态学研究结果基本一致。陈仁芳等(2010)对73份桑种质资源的ITS序列进行了分析，在此基础上探讨了桑属植物的系统位置与进化关系，发现桑属植物可由地理分布间接反映系统进化关系。王化坤等(2010)对核果类果树ITS序列分子进化及系统发育关系进行了研究，发现核果类果树各组ITS1和ITS2的分子进化速率不同，明确了核果类果树的演化顺序。

研究辣椒种质资源核糖体内转录间隔区(internal transcribed spaces, ITS)序列的多样性，对于辣椒种质资源鉴定、骨干亲本选择、亲缘关系分析以及系统发育与进化关系均具有重要意义。至今，国内外还未见利用ITS序列来进行辣椒不同种属种质资源材料遗传多样性和系统进化的研究报道。本文对辣椒属4个种不同生态类型的36份材料的ITS序列进行克隆，分析ITS序列长度、G+C含量以及变异、同源性和遗传分歧，探讨辣椒资源的遗传多样性和系统进化关系。

1结果与分析
1.1辣椒属内ITS序列变异分析
根据GenBank已公布的茄科18S rRNA基因3’端、26S rRNA基因5’端和5.8S rRNA基因碱基序列，确定本研究供试辣椒的ITS序列范围。软件分析结果显示，辣椒ITS基本序列全长656 bp，G+C含量57.47% (ITS1: 218 bp, G+C含量60.09%; ITS2: 275 bp, G+C含量60.00%; 5.8S: 163 bp, G+C含量49.69%) (图1)。

图1 辣椒属ITS基本序列 Figure 1 Capsicum ITS sequence base pairs arranged

供试的36份辣椒材料ITS序列均有不同程度变异，长度从624~698 bp不等，材料15S、42S、G20、G54的ITS序列最长(698 bp)，材料22S的最短(624 bp)。辣椒属植物ITS序列长度变异较大，且长度变异在ITS1、5.8S和ITS2区都有发生(表1)。

表1 辣椒属种质资源ITS长度及G+C含量变异 Table 1 Lengths of ITS sequences and its contents of C+C in Capsicum

辣椒ITS1基本长度为218 bp，材料15S、42S、G20和G54的ITS1长度最长(260 bp)，材料22S的最短(186 bp)。经MAGE 5.05软件分析后发现，供试辣椒材料ITS1总变异位点数153个，其中信息位点117个，单核苷酸多态(SNP) 36个。材料15S和G20的总变异数最多，共有47个，其次是42S、G42和G54，总变异位点数分别为44、42和42个，而材料3S的总变异位点数最少，仅为19个。

对供试材料ITS1序列进行比对分析后发现，材料4S、43S、G01、G114和G125的ITS1序列存在第33~38位点和第42~46位点的丢失现象，同时在第173位点后插入了9个碱基的序列，而又分别在第195位点后和第211位点增加和丢失一个G碱基序列。材料15S、42S、G20、G38、G42和G54在第111位点、第117位点和第118位点后分别插入1个、25个和16个bp的碱基。上述材料在ITS1序列变异上呈现出一定的规律性。在供试的36份辣椒材料中，12份材料(8S, 21S, 37S, G31, G32, G44, G47, G78, G108, G118, G132和G133) ITS1的第160位点丢失，表明这一位点容易发生变异。辣椒5.8S基本长度为163 bp，经MAGE 5.05软件分析后发现，供试辣椒材料5.8S总变异位点数82个，其中信息位点71个，单核苷酸多态(SNP) 11个。与其他作物5.8S序列相对保守而言，辣椒5.8S序列具有较高的变异性。材料G42和G54的变异数最多，为32个，其次是材料15S、42S和G20，变异数都为31个，而材料G08的变异数最少，仅为13个。37份材料的序列经MAGE 5.05软件进行聚类分析后发现，材料2S、G14、G68、G71、G88和G97以及4S、43S、G01、G114和G125分别在ITS序列的第245和第369位发生碱基丢失现象，表明辣椒5.8S的这两个位点容易发生变异。

辣椒ITS2基本长度为275 bp，经MAGE 5.05软件分析后发现，供试辣椒材料ITS2总变异位点数152个，其中信息位点129个，单核苷酸多态(SNP) 23个。材料15S、42S、G20、G42和G54具有较高的变异数，分别为58、58、58、57和56；材料G14、G68、G71、G88和G97的变异数最低，仅为20个。供试材料在ITS2区间变异数具有较大的区别。

材料8S、21S、37S、G31、G32、G44、G47、G78、G- 108、G118、G132和G133以及材料2S、G14、G68、G71、G88、G97分别在ITS序列的第398和第399位发生碱基丢失现象，结果表明辣椒5.8S的这两个位点容易发生变异。材料G35、G43、G74分别在ITS序列的第513~518位点和第635位点丢失7个和1个碱基，上述材料在ITS2序列变异上呈现出一定的规律性。

1.2 ITS序列同源性及遗传分歧分析
36份材料ITS的核苷酸序列长度不一，从624~ 698 bp不等。利用DNAman软件对上述36份材料的ITS序列进行同源性(Percent identify)和遗传分歧(Divergence)计算。结果表明，同源性范围为71.0%~ 100%，遗传分歧为0~0.360 4。其中，材料G114和G01，G133和G118，G54和G42、G74，G68和G88、G97以及G78和G31的ITS序列同源性最高，为100%；材料G20和22S的ITS序列同源性最低，仅为71.0%。材料G20和22S ITS序列的遗传分歧最大，为0.360 4；材料G114和G01，G133和G118，G54和G42、G74，G68和G88、G97以及G78和G31 ITS序列的遗传分歧最低，为0 (图2)。

图2 辣椒属材料ITS的遗传分歧分析 Figure 2 Genetic divergence analysis of ITS in Capsicum

1.3系统发育分析
根据测序结果，以烟草(GenBank: AJ492448.1)为外类群，采用邻位相连法和最大简约法对辣椒属材料所获得的ITS序列(ITS1+5.8S+ITS2)构建系统进化树。图3为邻位相连法构建的系统进化树，其中系统树分支上的数字为靴带分析(Bootstrap analysis, 1 000 replicates)抽样检验获得的分支支持率。对比两种方法构建的系统进化树，发现其拓扑结构基本相似。系统树拓扑结构表明，分支图首先将22S、G38和G48分出，其它辣椒材料分为3支。第一支包括：G42、G54、42S、15S和G20，自展支持率为100%；第二支包括：21S、G108、G47、G78、G44、G31、8S、G32、G118、G132、37S和G133，自展支持率也为100%；余下的16份辣椒材料以37%的自展支持率聚在一起，形成第三支。上述3个分支中各包含3个亚分支，其自展支持率都为100%。各分支都有很高的支持率，说明系统树上各组的系统关系可信度较高。

图3 根据ITS区序列数据用Kimura 2参数距离计算出的邻接树 注: 分支上面的数值代表自展支持率; A: Nicotiana tabacum Figure 3 The neighbor-joining tree using Kimura’s two parameter distances based on ITS sequences Note: Numbers above branches are bootstrap values (%) with 1 000 replicates; A: Nicotiana tabacum

2讨论
由于ITS进化速率较快、长度稳定性好、测序方便等特点，已成为研究植物分类和亲缘关系的重要工具(Bellarosa et al., 2005; Kress et al., 2005)。已有研究表明，大多数作物的ITS序列比较保守，尤其是5.8S区间，很多作物5.8S几乎没有序列变异(陈仁芳等, 2010; 宋葆华等, 2000; 江彪等, 2012)。本研究首次对辣椒属4个栽培种36份材料进行PCR扩增获得ITS序列，对序列进行分析后发现，供试的36份材料ITS序列均有不同程度变异，主要涉及碱基替换、插入和丢失，ITS序列的同源性从71.0%~ 100%不等，遗传分歧为0.0~0.360 4。其中，83.9%的同源性低于85%。序列比对发现，ITS总共有387个位点发生变异，其中ITS1、5.8S和ITS2各有153、82和152个，变异率分别为70.2%、50.3%和55.3%，说明辣椒属ITS序列变异性较大，保守性不强，尤其是辣椒属ITS序列的5.8S区间较其他物种具有更高的变异性。

本研究分析了辣椒属各材料ITS序列的变异位点。序列比对显示，共有387个变异位点，某些变异位点呈现明显的规律性，如在第33~38位和第42~46位丢失AACAAC和GCGAA，在第111、117和118位点后插入T、GCACACACGCCCAGCGTGCATGT和AGGCTACTAATGAAACCA。而发生相同变异的辣椒材料都被聚为一起，说明这些位点可作为辣椒种质DNA指纹鉴别关键位点。同时，ITS长度、G+C含量、变异位点均可作辣椒种质资源DNA特异指纹鉴别的依据，特别是碱基变异位点。相似的研究结果在桑属植物中也被观察到(陈仁芳等, 2010)。

根据ITS序列特征，经MEGA 5.05软件聚类分析后表明，22S (C. frutescens)、G38和G48(C. baccatum)被单独分出，其中G38和G48最先被分出。而21S (C. chinense)和C. annuum种的11份材料聚在一起，其中21S和樱桃椒G108又单独聚在一个亚分支。聚类结果说明C. annuum和C. chinense亲缘关系最近，其次是C. frutescens，而与C. baccatum亲缘关系较远。其中，C. annuum种的樱桃椒与C. chinense亲缘关系又较其他4个变种近。研究结果与前人基于分子标记、形态学和细胞学所得到的辣椒属亲缘关系结果一致(陈学军等, 2007; Pickersgill, 1997)，说明利用ITS序列可以用于辣椒属作物系统进化分析。

本文用于ITS研究的32份辣椒C. annuum种资源材料，包含C. annuum的5个变种，即长椒、灯笼椒、圆锥椒、樱桃椒和簇生椒，ITS序列后经MEGA 5.05软件分析聚类后显示，并不是所有相同果形的辣椒材料都聚在一起，每个亚分支起码包含两种果形的辣椒材料，说明并不能以辣椒果形来判断种质资源的亲缘关系远近，其他研究者利用不同的辣椒材料也得到了相似的研究结果(马艳青等, 2003; 陈学军等, 2007)，进而进一步证实目前辣椒C. annuum变种分类体系中以果实形态来判断辣椒C. annuum种质材料的亲缘关系并不完全准确。

3材料与方法
3.1材料 
供试的36份辣椒材料均由江苏省农业科学院蔬菜研究所辣椒项目组提供，具体编号及来源见表1。其中，21S为C. chinense栽培种，22S为C. frutescens栽培种，G38和G48为C. bacctuam栽培种，其余材料均为C. annuum栽培种。

3.2 DNA提取及ITS扩增
生长盛期采摘无病虫害辣椒嫩叶提取DNA，DNA提取方法采用CTAB法，略加改进，并利用紫外分光光度计测定浓度(Eppendorf公司生产) (刁卫平等, 2012)。ITS全序列(包括ITS1, 5.8S rRNA, ITS2)采用双引物扩增(江彪等, 2012)。上游引物序列为：5’-CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3’ (Stanford et al., 2000)，下游引物引物为5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (White et al., 1990)。PCR反应体系为：20 ng DNA模板，50 ng正反向引物，dNTPs 的2.5 mmol/L，2.5 mmol/L MgCl₂，2 μL 10×PCR Buffer和1 U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)，加ddH₂O至20 μL，扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 45 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 8 min。

3.4 PCR产物的回收、克隆及测序
用1.2%琼脂糖凝胶检测PCR产物，并用PCR纯化试剂盒(碧云天)回收。回收产物经纯化后连接于pGEM-T Easy (Promega)上，并转化DH5α感受态细胞，37℃培育12~14 h后，挑取单克隆，在含有60 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中培育过夜，PCR鉴定阳性克隆，并送往南京思普金生物科技有限公司测序(刁卫平等, 2012)。

3.5序列分析
利用DNAman和Clustal X 1.83软件对测序结果进行分析，确定ITS序列(ITS1+5.8S rRNA+ITS2)，Bio XM软件明确各个序列的GC含量，利用MEGA 5.05软件进行碱基替换的同质性检测。利用MEGA 5.05软件进行系统发育分析，构建邻接树(Neighbor-joining tree)和最大简约树(Maximum parsimonytree)，以自展法(Bootstrap analysis, 1 000 replicates)进行(Tamura et al., 2011; 江彪等, 2012)。

作者贡献
刁卫平是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；刘金兵和潘宝贵参与实验设计，试验结果分析；戈伟提供试验材料；王述彬是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-25)、国家科技支撑计划项目(2012BAD02B02)和江苏省农业科技自主创新资金体系类项目(CX-(12)1004)共同资助。

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