新疆凭借独特的自然条件已成为中国最大的棉花产区，在6.7×10⁴ km²耕地中，棉花种植面积达1.6×10⁴ km²，占全国棉花种植面积的三分之一，产量占全国棉花总产量的一半左右(http://news.xinhuanet.com/fortune/2012-12/28/c114194610.htm/)。棉花产业已经成为新疆当地国民经济发展的支柱产业之一(http://www.aks.gov.cn/Article/Print.asp?ID=104120/)。但新疆地处中国西北内陆，干旱少雨，春季气温回升慢，秋季降温快、枯霜期早，加上连年种植棉花，病虫害如黄萎病有加重趋势(董承光等, 2011)。因此针对新疆特定生态条件而开展的棉花早熟、抗旱、抗黄萎病等品种培育对保障新疆棉花生产的高产稳产显得尤为重要(董承光等, 2011; 郑巨云等, 2010, 中国棉花, 37(11): 2-5)。

转基因抗虫棉的成功应用展现了转基因技术在棉花育种中的巨大潜力，通过转基因技术可以培育高产优质多抗棉花新品种(Chakravarthy et al., 2012; Wu et al., 2008b)。目前棉花转基因主要依赖于体细胞胚发生再生植株的途径，要将目的基因成功转化到棉花中，其前提是需有棉花受体的高效遗传转化体系(Zhang, 2013)。早期报道通过体细胞胚胎再生植株的新疆陆地棉品种有新陆早1号、新陆早4号、新陆早7号、新陆早8号、新陆早10号、新陆早17号、新陆中2号和新陆中4号等(Zhu and Sun, 2000; 王芳等, 1997; 2004; 黄全生等, 2005; 孟庆玉等, 1995, 新疆农业科学, (3): 109-111)。近年来，新疆陆地棉可再生基因型范围进一步拓宽，通过体细胞胚胎发生途径成功再生植株的品种包括新陆早24、新陆早33、新陆早42、新陆中20和03298等(焦天奇等, 2012; 刘丽等, 2011; 陈天子等, 2008)。但成功用于遗传转化的品种极少，主要原因是一些品种虽然具有体细胞胚胎发生能力，但体细胞胚胎发生率低，植株再生能力弱，导致遗传转化效率极低，难以作为遗传转化受体。

前期研究发现新疆陆地棉03298品系具有良好的体细胞胚胎发生能力，在适当的培养条件下6个月即可获得完整再生植株，具有作为新疆陆地棉遗传转化受体的潜质(陈天子等, 2008)。但受体品种的胚胎发生能力在不同种子间存在差异，只有经过连续鉴定和选择获得胚胎发生能力高的纯系，才能大幅提高棉花再生率和转化率(吴家和等, 2003)。作为遗传转化的受体应该有稳定的高再生率，03298品系未经筛选鉴定而直接用于遗传转化可能会因整体的胚胎发生能力低而制约遗传转化效率。

本研究通过连续3次组织培养再生，筛选具有高频再生率的03298再生系，以其为受体进行遗传转化可大幅提高棉花的转化率，为新疆陆地棉的遗传改良提供优良、高效的受体种质，并建立了相应的高效遗传转化体系。

1结果与分析
1.1连续组织培养定向筛选提高棉花体细胞胚胎再生系的转化率
03298R1为03298原始种子第一次组织培养再生获得的单株所收获的种子，部分用于组织培养，开花最早的再生植株单株自交获取03298R2，部分用于农杆菌介导的遗传转化。从表1可以发现，03298R1下胚轴和子叶外植体在卡那霉素筛选下愈伤率50%左右，整体转化率约为5%。经过第二轮组织培养筛选后，03298R2外植体的转化效率可以提高到10%~15%左右，比03298R1外植体的转化率高出1~2倍；由于遗传转化过程中的影响因素众多，愈伤率在03298R2不同的转化批次间差异较大，但3次转化的平均愈伤率约为79%，远高于03298R1的49%愈伤率。同样，03298R2部分种子也用于再生获取下一代再生系03298R3，以03298R3下胚轴和子叶外植体进行转化，愈伤率进一步提高到110%以上，是03298R1愈伤率2~3倍，转化率更是提高到23%~33%，是03298R1转化率的4~6倍。

表1 03298再生系的遗传转化效率 Table 1 The transformation efficiency of 03298 regenerated lines

1.2抗性愈伤的诱导
03298再生系下胚轴和子叶外植体在选择培养基培养20 d后，在其切口处明显可见膨大的愈伤(图1A-图1B)，将其剥离外植体后继代于选择培养基，抗性愈伤生长增殖迅速，培养15 d后，已形成直径1.5~2.0 cm左右的愈伤块，非抗性愈伤则在此轮抗性筛选中无法增殖(图1C)。

图1 农杆菌介导转化03298再生系的过程图 注: A: 03298下胚轴外植体在选择培养基CIMS培养20 d后产生的抗性愈伤; B: 03298子叶外植体在选择培养基CIMS培养20 d后产生的抗性愈伤; C: 03298抗性愈伤在选择培养基CIMS继代15 d时迅速增殖; D: 抗性愈伤转移至MSBP培养基培养20 d时愈伤颜色和质地逐渐变化; E: 抗性愈伤在MSBP培养基继代培养产生颗粒状疏松质地的愈伤组织; F: 抗性愈伤在MSBP培养基继代培养产生大颗粒状的胚性愈伤; G: MSBF培养基中体细胞胚胎发生的球形胚状体和鱼雷形胚状体; H: MSBF培养基中体细胞胚胎发生的子叶形胚状体; I: 转化6个月后在MSBF培养基培养再生的小植株; J: 在MSBP培养基培养的再生植株; K: 移栽30 d后的再生植株; L,M: 温室中移栽的再生植株 Figure 1 The process of Agrobacterium-mediated transformation of 03298 regenerated line Note: A: Kanamycin-resistant calli generated from hypocotyl explants after 20 d culture on CIMS selective medium; B: Kanamycin-resistant calli generated from cotyledonary explants after 20 d culture on CIMS selective medium; C: Kanamycin-resistant calli proliferated on second round of CIMS selective medium; D,E: Kanamycin-resistant calli propagated on MSBP medium; F: Embryogenic calli generated on MSBP medium; G: Globular and torpedo embryos on MSBF medium; H: Cotyledonary embryos on MSBF medium; I: Regenerated plantlet on MSBF medium; J: Regenerated plantlet on MSBP medium; K: Transplanted plantlets in small paper pots; L,M: Transplanted plantlets in glasshouse

在50 mg/L卡那霉素选择压力和0.1 mg/L KT+0.1 mg/L 2,4-D的激素诱导条件下，03298再生系下胚轴外植体和子叶外植体的愈伤率(愈伤数/外植体数)在不同转化批次间差别较大，但下胚轴外植体的总体愈伤率(97%)比子叶外植体的总体愈伤率(71%)稍高(以2011年03298R2三批次的转化统计结果为例) (表2)。

表2 03298再生系下胚轴和子叶外植体的愈伤发生率 Table 2 The rate of calli generated from transformed hypocotyl and cotyledonary explants from 03298 regenerated lines

1.3愈伤增殖及胚性愈伤的诱导
抗性愈伤组织直径在1.5 cm以上可以转移至MSBP培养基进行愈伤组织的增殖。抗性愈伤组织由CIMS培养基转移到MSBP培养基进行愈伤增殖后，愈伤颜色和质地会发生变化，由灰白色、软泥状的愈伤形态(图1C)变为绿色、灰绿色、浅黄绿色、疏松质地的愈伤形态(图1D)。愈伤在MSBP培养基增殖一个月后，愈伤质地会进一步发生分化，形成两大类愈伤组织：颗粒状疏松质地的愈伤组织(图1E)和絮状虚松质地的疯长型愈伤组织。在后续培养过程中，连续选择颗粒状疏松质地的愈伤组织在MSBP培养基中继代培养，3~4月后即可诱导体细胞胚胎发生，形成大颗粒状的胚性愈伤(图1F)。

1.4体细胞胚胎的成熟和植株再生
为促进体细胞胚胎的成熟，在MSBP培养基产生的胚性愈伤转移至MSBF培养基中培养，继代1~2次后形成肉眼可见的球形胚状体、鱼雷形胚状体(图1G)。进一步培养，可获得子叶型胚状体(图1H)和再生幼苗(图1I; 图1J)。获得3 cm高再生幼苗的最短时间为6个月，而集中收获再生苗的时间在转化后8~9个月。由于经过筛选，03298再生幼苗的生根能力较强，可在MSBF培养基或MSBP培养基中生根。再生幼苗长至6~8 cm时，取根系良好者移栽至有机栽培基质(图1K)，罩上塑料杯保湿，待幼苗存活后20~30 d左右移去塑料杯，移栽温室(图1L; 图1M)。

1.5转基因棉花的分子检测 
移栽存活的再生棉花植株提取DNA，PCR扩增检测再生苗中的选择标记NPTII基因，图2A所示为部分植株的PCR检测结果。在22株检测的植株中，除18号植株没有扩增出特异条带外，其余21株均呈PCR阳性，初步认定这些植株为转基因植株。

图2 PCR和southern杂交检测03298转基因植株中的NPTII基因 注: A: PCR检测转基因植株中的NPTII基因; M1: DL2000 marker; wt: 03298受体DNA; p: 质粒阳性对照; 1~22: 03298再生植株; B: 以地高辛标记的NPTII基因为探针进行Southern杂交检测转基因植株中的NPTII基因; M: Lambda-EcoT14 I digest DNA marker; wt: 03298受体DNA; a~d: 03298转基因植株, a植株呈2条杂交带, b植株呈1个杂交带, c和d呈3条杂交带 Figure 2 Analysis of NPTII gene in transgenic 03298 plants by PCR and southern blot Note: A: PCR analysis of NPTII gene integrated into the transgenic cotton plants; M: DL2000 marker; wt: 03298 genomic DNA; p: Vector DNA; 1~22: Regenerated plants from 03298 explants under Agrobacterium transformation; B: Southern blot of transge- nic cotton plants with DIG-labeled NPTII gene; M: LambdaEcoT14 I digest DNA marker; wt: 03298 genomic DNA, a~d: Transgenic 03298 plants

20 μg基因组DNA经EcoRⅠ酶切、电泳、转膜后，以地高辛标记的NPTII基因为探针进行Southern杂交检测(图2B)，结果显示四个独立转基因株植株均呈现杂交信号，其中a植株呈2条杂交带，b植株呈1个杂交带，c和d呈3条杂交带，证明NPTII基因已经整合入这些植株的基因组。

2讨论
农杆菌介导的遗传转化是目前棉花转基因研究采用的主要方法，高效农杆菌转化体系对于棉花转基因产业化和功能基因组学等研究具有重要意义。目前农杆菌介导的棉花遗传转化方法主要沿袭农杆菌介导转化珂字棉下胚轴(Umbeck et al., 1987)和珂字棉子叶(Firoozabady et al., 1987)的两个研究，且所报道的遗传转化受体也多为含珂字棉遗传背景的材料。为适应中国生产实际，国内研究人员建立了一些农艺性状优良的国内品种如中棉35 (Wu et al., 2006; 2008a; 吴家和等, 2004; 谢龙旭等, 2004)、冀合321 (Guo et al., 2003; 刘传亮等, 2004; 吴家和等, 2004)、晋棉7号(Chen et al., 2002; 焦改丽等, 2002; 张慧军等, 2007; 陈志贤等, 1994)、泗棉3号(刘传亮等, 2004; 吴慎杰等, 2007)、鲁棉6号(刘传亮等, 2004)等农杆菌介导的遗传转化体系。新疆陆地棉如新陆早1号、新陆中9号和彩棉等也成功用于棉花转基因研究(Chen et al., 2002; Wu et al., 2005; Zhu et al., 2006)。但这些受体材料均以下胚轴或下胚轴产生的胚性愈伤作为遗传转化的外植体，少有对子叶外植体的遗传转化，可能是实验室偏好和操作习惯使然，也可能是相同的培养体系中下胚轴比子叶更易于操作、遗传转化效率高。在本研究的同一激素培养体系中，03298再生系子叶外植体的总体愈伤率比下胚轴外植体的总体愈伤率稍低，但其总体愈伤率仍在70%以上(表1)，表明03298再生系的子叶也可作为遗传转化外植体，与下胚轴外植体在相同的激素培养体系中培养也能很好地诱导抗性愈伤(表2)，提高了遗传转化外植体利用率。此外，我们还发现子叶作为遗传转化外植体的优势在于其产生的抗性愈伤在后期培养过程中更易于诱导体细胞胚胎的发生。

有些棉花品种虽具再生能力，但再生能力弱，一般难以用作遗传转化受体材料。吴家和等(2003)等通过组织培养鉴定珂字312和冀合321两个棉花品种的体细胞再生能力，经过两次自交和两次组织培养，珂字312的再生能力由22%上升到96%，冀合321的再生率由11%上升到81%，获得再生能力强的纯化株系。03298原品种的再生率较低，直接用于遗传转化难以获得满意的转化效果。经过三次组织培养筛选后，03298再生系的下胚轴和子叶外植体总体分化率(独立转化事件数/外植体数)由5% (03298R1)提高到10%~15% (03298R2)再到23%~33% (03298R3) (表2)，这得益于03298再生系的体细胞胚胎发生能力的大幅提高。经过组织培养筛选后的03298再生系具有03298原品系的优良农艺性状，可以作为新疆陆地棉遗传转化的受体，在我们的遗传转化体系(表3; 图1)中，最快6个月即可获得3 cm高的再生幼苗，历时8~9个月集中出现分化幼苗。

表3 棉花03298农杆菌介导遗传转化体系的培养基 Table 3 Media used in the Agrobacterium-mediated transformation of cotton variety 03298

3材料与方法
3.1材料
实验起始材料为新疆陆地棉03298品系经组织培养获得的再生植株单株自交种(陈天子等, 2008)，命为03298R1。以此类推，03298R1组织培养的再生植株单株自交种命名为03298R2，03298R2组织培养的再生植株单株自交种命名为03298R3。

3.2体细胞胚胎发生的再生体系
新疆陆地棉03298品系的体细胞胚胎再生体系参照其已报道的培养基体系进行(陈天子等, 2008)。取03298再生系的自交种子，浓硫酸脱绒后，种子经75%酒精表面消毒1 min，30%过氧化氢(H₂O₂)消毒4 h后，以无菌水冲洗4次，然后无菌水浸种24 h至露白。在无菌条件下剥去种皮，将种仁接种于苗培养基(1/2MS+0.25% Phytagel (W/V), pH 5.8)，28℃暗培养3 d，16 h/8 h光照周期下培养3 d，即获得棉花无菌苗。取棉花无菌苗下胚轴切断1 cm左右，纵向将其一分为二，纵切面朝下接种于CIM愈伤组织诱导培养基(表4)。一个月后转移至MSBP培养基，每隔一个月继代于MSBP培养基上，直至产生胚性愈伤。将胚性愈伤转移至MSBF培养基，促进体细胞胚胎发生，每隔一个月继代于MSBF培养基上，直至幼苗形成。在MSBF培养基上形成的幼苗长至2~3 cm时，转移至MSBP培养基培养，幼苗长至6~8 cm时，取根系良好者，洗净根上培养基，移栽至有机栽培基质，罩上塑料杯保湿，待幼苗存活后20~30 d左右移去塑料杯，移栽至温室。

表4 棉花03298体细胞胚胎发生再生体系的培养基 Table 4 Media used in the regeneration of cotton variety 03298

3.3农杆菌介导的遗传转化体系
取03298再生系的自交种子按前述方法制备棉花无菌苗。切取无菌苗下胚轴(1 cm左右)和子叶(1 cm×1 cm左右)外植体，用含有目的基因(含NPTII选择标记基因)的农杆菌LAB4404菌液(OD600=0.3左右)浸染10 min，外植体表面菌液用无菌滤纸吸干后，转移至Co-culture共培养基(表3)，23℃暗培养2 d后，转移至CIMS选择培养基，28℃、16 h/8 h光照周期培养，培养20~30 d后切取抗性愈伤，继代于CIMS选择培养基。抗性愈伤培养15~30 d后，转移至MSBP培养基，每隔一个月继代于MSBP培养基上，直至产生胚性愈伤。将胚性愈伤转移至MSBF培养基，促进体细胞胚胎发生，每隔一个月继代于MSBF培养基上，直至幼苗形成。幼苗的移栽方法如前所述。

3.4转基因再生苗的分子检测
CTAB法(Paterson et al., 1993)提取转基因再生苗DNA，PCR扩增检测再生苗中的选择标记NPTII基因(引物5’-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3’和5’-TAGAAGGCGATGCGCTGCGA-3’)，扩增片段大小为750 bp，扩增程序为95℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。

CTAB法(Paterson et al., 1993)提取转基因再生苗DNA，基因组DNA以EcoRⅠ(Takara)酶进行酶切，然后在0.7%琼脂糖凝胶电泳分离后，通过毛细作用转移到Hybond-N+尼龙膜(Amersham)，然后以地高辛标记的NPTII基因为探针，按地高辛试剂盒Dig DNA Labeling and Detection Kit Ⅰ(Roche)说明进行Southern杂交。

作者贡献
陈天子和杨郁文是本研究的实验设计和实验研究的执行人；陈天子、杨郁文及张保龙完成数据分析，论文初稿的写作；邓惠清、刘正銮和刘蔼民参与实验设计，试验结果分析与讨论；张保龙是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由2012年江苏省农业科技自主创新资金(CX(12)2023)和2012年江苏省科技支撑计划(BE- 2012337)共同资助。

参考文献
Chakravarthy V.S., Reddy T.P., Reddy V.D., and Rao K.V., 2012, Current status of genetic engineering in cotton (Gossypium hirsutum L): an assessment, Crit. Rev. Biotechnol., pp.1-18

Chen T.Z., Wu S.J., Li F.F., Guo W.Z., and Zhang T.Z, 2008, In vitro regeneration of four commercial cotton (Gossypium hirsutum L.) cultivars grown in Xinjiang, China, Zuowu Xuebao (Acta Agronomica Sinica), 34(8): 1374-1380 (陈天子, 吴慎杰, 李飞飞, 郭旺珍, 张天真, 2008, 新疆棉花4个主栽品种的体细胞胚胎发生及植株再生, 作物学报, 34(8): 1374-1380)

Chen W.X., Xiao G.F., and Zhu Z., 2002, Obtaining high pest- resistant transgenic upland cotton cultivars carrying cry1Ac3 gene driven by chimeric OM promoter, Acta Botanica Sin- ica, 44(8): 963-970

Chen Z.X., llwellyn D.J., Fan Y.L., Li S.J., Guo S.D., Jiao G.L., and Zhao J.X., 1994, 2,4-D resistant transgenic cotton plants produced by Agrobacterium-mediated gene transfer, Zhongguo Nongye Kexue (Scientia Agricultura Sinica), 27(2): 31-37 (陈志贤, llwellyn D.J., 范云六, 李淑君, 郭三堆, 焦改丽, 赵俊侠, 1994, 利用农杆菌介导法转移tfdA基因获得可遗传的抗2,4-D棉株, 中国农业科学, 27(2): 31-37)

Dong C.G., Li B.C., Li S.X., Zhou X.F., Ma X.M., and Xiao G.S., 2011, Progress and problems of early-maturity upland cotton breeding in north Xinjiang area, Zhongguo Mianhua (China Cotton), 38(12): 8-10 (董承光, 李保成, 李生秀, 周小凤, 马晓梅, 肖光顺, 2011, 新疆北疆早熟棉育种进展现状及存在的问题, 中国棉花, 38(12): 8-10)

Firoozabady E., DeBoer D.L., Merlo D.J., Halk E.L., Amerson L.N., Rashka K.E., and Murray E.E., 1987, Transformation of cotton (Gossypium hirsutum L.) by Agrobacterium tumefaciens and regeneration of transgenic plants, Plant Mol. Biol., 10(2): 105-116

Guo H.N., Wu J.H., Chen X.Y., Luo X.L., Lu R., Shi Y.J., Qin H.M., Xiao J.L., and Tian Y.C., 2003, Cotton plants transformed with the activated chimeric Cry1Ac and API-B genes, Acta Botanica Sinica, 45(1): 108-113

Huang Q.S., Wei X.W., Meng Q.Y., Wang D.M., and Huang L.P., 2005, The study on somatic embryogenesis and plant regeneration in cotton, Xinjiang Nongye Kexue (Xinjiang Agricultural Science), 42(4): 269-271 (黄全生, 危晓薇, 孟庆玉, 王冬梅, 黄乐平, 2005, 早熟陆地棉体细胞培养胚胎发生和植株再生的研究, 新疆农业科学, 42(4): 269-271)

Jiao G.L., Li J.F., Li Y.E., Zhao J.X., Zhang H.Y., and Liu J.W., 2002, Research on the utilization of new explants to esta- blish a high efficiency transformation system in cotton, Mianhua Xuebao (Cotton Science), 14(1): 22-27 (焦改丽, 李俊峰, 李燕娥, 赵俊峡, 张换样, 刘建卫, 2002, 利用新的外植体建立棉花高效转化系统的研究, 棉花学报, 14(1): 22-27)

Jiao T.Q., Wu S.J., Liu R.N., Li J., Zhang H.Y., Jiao G.L., and Zhu J.B., 2012, Somatic embryogenesis and plant regeneration in the Gossypium hirsutum L. cultivar Xinluzao42, Mianhua Xuebao (Cotton Science), 24(3): 238-243 (焦天奇, 吴慎杰, 刘瑞娜, 李静, 张换样, 焦改丽, 祝建波, 2012, 新陆早42号体细胞胚发生和植株再生, 棉花学报, 24(3): 238-243)

Liu C.L., Wu Z.X., Zhang C.J., Li F.L., Wang Y.F., and Li F.G., 2004, Study on large-scale and high efficient transformation system mediated by Agrobacterium tumefaciens of cotton, Xibei Zhiwu Xuebao (Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica), 24(5): 768-775 (刘传亮, 武芝霞, 张朝军, 李凤莲, 王玉芬, 李付广, 2004, 农杆菌介导棉花大规模高效转化体系的研究, 西北植物学报, 24(5): 768-775)

Liu L., Wang J., Wang X.W., Zhou X.F., Kong X.H., and Yu Y., 2011, Comparative study of somatic embryogenesis and plant regeneration in cotton cultivars from Xinluzao 32 and Xinluzao 33 (Gossypium hirsutum L.), Mianhua Xuebao (Cotton Science), 23(3): 259-264 (刘丽, 王娟, 王旭文, 周小凤, 孔宪辉, 余渝, 2011, 新陆早32号, 33号的体细胞胚胎发生和植株再生比较研究, 棉花学报, 23(3): 259-264)

Paterson A.H., Brubaker C.L., and Wendel J.F., 1993, A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis, Plant Mol. Biol. Rep., 11(2): 122-127

Umbeck P., Johnson G., Barton K., and Swain W., 1987, Genetically transformed cotton (Gossypium hirsutum L.) plants, Nat. Biotechnol., 5(3): 263-266

Wang F., Mao H.C., Yao Y.S., Cai J.F., and Zhang P.L., 1997, Research on enhancing the embryos and the rate of regenera- ted plant of upland cotton, Xinjiang Nongye Daxue Xuebao (Journal of Xinjiang Agricultural University), 20(4): 56-59 (王芳, 毛鸿才, 姚源松, 蔡吉凤, 张佩玲, 1997, 提高陆地棉胚状体和再生植株率的研究, 新疆农业大学学报, 20(4): 56-59)

Wang F., Liu L.J., Zhang P.L., Wen F., and Yao Y.S., 2004, High frequency somatic embryogenesis and plant regeneration of Gossypium hirsutum in Xinjiang, Xinjiang Nongye Daxue Xuebao (Journal of Xinjiang Agricultural University), 27(1): 29-34 (王芳, 刘利君, 张佩玲, 文峰, 姚源松, 2004, 新疆陆地棉胚状体发生高效再生体系的建立, 新疆农业大学学报, 27(1): 29-34)

Wu J.H., Zhang X.L., Luo X.L., and Xiao J.L., 2003, Selection of somatic embryogenesis pure lines of tow upland cotton (Gossypium hirsutum L.) cultivars, Mianhua Xuebao (Cotton Science), 15(4): 254-256 (吴家和, 张献龙, 罗晓丽, 肖娟丽, 2003, 两个陆地棉体细胞胚胎发生新品系的选育, 棉花学报, 15(4): 254-256)

Wu J.H., Zhang X.L., Luo X.L., Nie Y.C., Tian Y.C., and Chen Z.H., 2004, Transgenic cotton plants of chitinase and glu- canase genes and their performance of resistance to Verticilium dahliea, Yichuan Xuebao (Acta Genetica Sinica), 31(2): 183-188 (吴家和, 张献龙, 罗晓丽, 聂以春, 田颖川, 陈正华, 2004, 转几丁质酶和葡聚糖酶基因棉花的获得及其对黄萎病的抗性, 遗传学报, 31(2): 183-188)

Wu J.H., Luo X.L., Guo H.N., Xiao J.L., and Tian Y.C., 2006, Transgenic cotton, expressing Amaranthus caudatus agglutinin, confers enhanced resistance to aphids, Plant Breeding, 125(4): 390-394

Wu J.H., Luo X.L., Wang Z.A., Tian Y.C., Liang A.H., and Sun Y., 2008a, Transgenic cotton expressing synthesized scorpion insect toxin AaHIT gene confers enhanced resistance to cotton bollworm (Heliothis armigera) larvae, Biotechnol. Lett., 30(3): 547-554

Wu K.M., Lu Y.H., Feng H.J., Jiang Y.Y., and Zhao J.Z., 2008b, Suppression of cotton bollworm in multiple crops in China in areas with Bt toxin-containing cotton, Science, 321(5896): 1676-1678

Wu S.J., Li F.F., Chen T.Z., Zhang J., Guo W.Z., and Zhang T.Z, 2007, Agrobacterium-mediated transformation of upland cotton Simian 3, Zuowu Xuebao (Acta Agronomica Sinica), 33(4): 632-638 (吴慎杰, 李飞飞, 陈天子, 张洁, 郭旺珍, 张天真, 2007, 利用农杆菌介导法转化泗棉3号的研究, 作物学报, 33(4): 632-638)

Wu X., Wang J.J., Zhu Z., Shangguan X.X., Zhang L.S., Li B., Du C.F., and Li Y.E., 2005, Study of transgenic cotton carrying Bt-CpTI-GNA genes, Cotton Science, 17(6): 353-359

Xie L.X., Li Y.F., and Xu P.L., 2004, Glyphosate-resistant cotton (Gossypium hirsutum L.) transformed with aroAM12 gene via Agrobacterium tumefaciens, Zhiwu Shengli Yu Fenzi Shengwuxue Xuebao (Journal of Plant Physiology and Molecular Biology), 30(2): 173-178 (谢龙旭, 李云锋, 徐培林, 2004, 根癌农杆菌介导的转aroAM12基因棉花植株的草甘膦抗性, 植物生理与分子生物学学报, 30(2): 173-178)

Zhang B.H., 2013, Transgenic cotton: from biotransformation methods to agricultural application, Methods Mol. Biol., (958): 3-15

Zhang H.J., Wang H.Y., Shi Y.J., Zhang Y.M., Yue J.X., Wu S.J., Zhu Y.H., Liu Y.L., and Yang H.Y., 2007, Cotton genetic transformation of barnase male sterility gene, Mianhua Xuebao (Cotton Science), 19(4): 261-266 (张慧军, 王寰宇, 石跃进, 张玉满, 岳建雄, 吴慎杰, 朱永红, 刘玉乐, 杨怀义, 2007, 雄性不育基因对棉花的遗传转化, 棉花学报, 19(4): 261-266)

Zhu S.W., and Sun J.S., 2000, Rapid plant regeneration from cotton (Gossypium hirsutum L.), Chinese Sci. Bull., 45(19): 1771-1774

Zhu S.W., Gao P., Sun J.S., Wang H.H., Luo X.M., Jiao M.Y., Wang Z.Y., and Xia G.X., 2006, Genetic transformation of green-colored cotton, In Vitro Cell. Dev-An., 42(5): 439-444