植物油不仅用于食用，在化工领域也有重要的应用价值，一些具有特殊理化性质的植物油可以满足工业领域的特殊需要。在植物和细菌中有一类脂肪酸，包括环丙烷脂肪酸(CPA-FAs)和环丙烯脂肪酸(CPE-FAs)，由于三碳碳环的存在，赋予这类脂肪酸兼具有饱和和不饱和脂肪酸的特性，在化工领域中有特殊用途。例如，润滑油的组分一般为含有16~18个碳的长链脂肪酸，但是长链饱和脂肪酸的熔点较高，不能满足发动机的需求，而长链不饱和脂肪酸又很容易氧化，环丙烷脂肪酸的特征正好可以解决这一矛盾(Kai and Pryde, 1982; Bao et al., 2011)。利用氢化作用使碳环打开，环丙烷脂肪酸可以产生大量有甲基分支的脂肪酸，这将使其具有不饱和脂肪酸及其酯的低温特性，又没有双键的易氧化性，因此可以用于润滑及相关领域(Patterson et al., 2012)。另外，环丙烯环在与亲电子试剂的放热反应中容易打开，环丙烯脂肪酸含量高的油，如臭苹婆油可以在升高的温度下聚合，这种特性特别适用于聚合物的生产(Bao et al., 2011)。

CPE-FAs和CPA-FAs仅存在于有限的高等植物种子油中，包括锦葵科、梧桐科、木棉科和无患子科。但是一般认为CPE-FAs是抗营养因子并对人类健康有害(Bao et al., 2002)。人们希望得到CPA-FAs含量高而CPE-FAs含量低的植物油，但是事实上二者的比例在植物油中却是相反的。比如香苹婆种子中的CPE-FAs可以达到脂肪酸总量的65%~78% (Bao et al., 2002)。因此，研究人员希望能够鉴定和分离植物中CPA-FAs的合成基因，然后在植物中过表达这种基因，以期得到CPA-FAs含量高的种质材料。Grogan和Cronan (1984)最早在细菌中鉴定出CPA-FAs合成的关键基因环丙烷脂肪酸合酶；植物中最早在香苹婆鉴定出该基因，并且发现该基因比细菌中的同源基因长2倍，在N端含有FAD氧化酶结构域，C端具有甲基转移酶结构域(Bao et al., 2002)。尽管香苹婆、荔枝等种子中的CPE-FAs和CPA-FAs含量较高，但利用最多、最广泛的含有CPE-FAs和CPA-FAs的油却是棉籽油，棉籽油中仅含有1%的CPE-Fas (Liu et al., 2012)。目前，有关香苹婆和荔枝的环丙烷脂肪酸合酶基因已经被报道(Bao et al., 2002; 2003; 2011)，但是关于这类基因的启动子还未见相关报道。

本研究利用染色体步移获得一个棉花环丙烷脂肪酸合酶基因CPA-FAS-2的启动子区域，对该段区域进行了生物信息学分析，构建了该片段与GUS基因融合的重组载体并转化拟南芥。对转化株进行的GUS染色结果表明，在幼苗期未见染色信号，而在生长发育后期即生殖发育期，GUS基因表现为组织表达差异性特征，只在种子、茎基部、根以及花药表达。进一步利用GUS定量分析，结果表明该启动子受P缺失和干旱条件的诱导。

1结果与分析
1.1棉花环丙烷脂肪酸合酶基因CPA-FAS-2启动子区的获得
通过染色体步移，PCR扩增获得了1个长度为3.2 kb的DNA片段(图1)。对该片段测序，发现与登录的棉花CPA-FAS-2基因序列有513个核苷酸的重叠区，表明该片段就是基因CPA-FAS-2的5’侧翼区，并将该片段命名为pCPA-FAS-2。

图1 染色体步移获得pCPA-FAS-2 注: 1: pCPA-FAS-2 Figure 1 pCPA-FAS-2 obtained by chromosome walking Note: 1: pCPA-FAS-2

1.2 CPA-FAS-2启动子区的生物信息学分析
根据获得的片段，设计引物pCPA-FAS-2-HindⅢ和反向引物pCPA-FAS-2-BamHⅠ扩增启动子片段，扩增得到约2.7 kb条带。用PLACE对该条带进行生物信息学分析，并将CPA-FAS-2的起始密码子(ATG)记为+1，即图2中自5’端的第2659位碱基。预测结果表明该段序列含有组织特异表达元件，如种子特异表达元件2SSEEDPROTBANAPA和EBOXBNNAPA；根特异元件OSE1ROOTNODULE和RHERPATEXPA7；花器官特异元件POLLEN1LELAT52。逆境胁迫响应元件，如抗病反应相关表达元件BIHD1OS、GT-1 motif和WBOXHVISO1；干旱诱导元件ACGTATERD1和MYB2CONSENSUSAT；磷缺乏响应元件P1BS、硫缺乏响应元件SURECOREATSULTR11和铜离子诱导表达元件CURECORECR。除此之外，还含有植物激素响应元件，如细胞分裂素诱导元件CPBCSPOR和水杨酸诱导元件WBOXATNPR1等(表1)。

图2 pCPA-FAS-2的核苷酸序列 注: ATG为转录起始位点, 定义为+1 Figure 2 The nucleotide sequence of pCPA-FAS-2 Note: ATG is transcription initiation site and defined as +1

表1 pCPA-FAS-2序列中的调控元件分析 Table 1 analysis of regulatory elements in the pCPA-FAS-2

1.3 pCPA-FAS-2与GUS基因融合重组载体的构建
以柯字棉312基因组为模板，用pCPA-FAS-2-HindⅢ和pCPA-FAS-2-BamHⅠ扩增启动子片段，扩增得到约2.7 kb条带。测序正确后与PBI101载体连接，挑取阳性克隆经酶切鉴定，证明目的序列已经插入到PBI101中。将该载体命名为PBI101-pCPA- FAS-2 (图3)。

图3 PBI101-pCPA-FAS-2载体构建示意图 Figure 3 The diagram of PBI101-pCPA-FAS-2

1.4转基因拟南芥的获得与GUS染色结果
在含有40 mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选出的绿苗移栽至营养土中，利用引物pCPA-FAS-2-HindⅢ和pCPA-FAS-2-BamHⅠ鉴定，共获得6个转基因T₀代植株。利用T₁代植株进行GUS活性的组织化学定位分析，在幼苗期全株检测不到染色信号(图4A)，说明GUS基因没有表达。而在生殖发育期，检测到染色信号，并且表现为组织特异性。在转基因植株中，GUS基因在茎基部(图4B)以及根中的表达很强(图4C)。另外，在花药(图4D)，和种子中也有较强的染色信号(图4E)。

图4 PBI101-pCPA-FAS-2转基因拟南芥的GUS 组织化学染色 注: A: 幼苗; B: 茎基部; C: 根; D: 花; E: 种子以及荚; 箭头指向: 染色信号 Figure 4 GUS histochemical assay of PBI101-pCPA-FAS-2 transformed Arabidopsis Note: A: Seedling; B: Basal part of stem; C: Root; D: Flower; E: Seed and pod; Arrow: Staining signal

1.5 pCPA-FAS-2是P缺失和干旱诱导启动子
对pCPA-FAS-2生物信息学分析的结果表明，其含有根，花器官以及种子特异表达元件，还含有磷(P)、硫(S)缺乏、病原菌和干旱等逆境响应元件。为了进一步验证该启动子的特征，利用GUS定量分析磷(P)缺失和干旱条件对其表达的影响。在P缺失条件下，pCPA-FAS-2活性增加，并在诱导3~5 d时达到最大值，为未诱导植株的5~7倍，随后下降并在7 d后回到正常值。用PEG6000模拟干旱诱导条件，诱导后启动子活性明显增加，在诱导后12 h达到最大值，为未诱导植株的9~13倍(图5)。说明pCPA-FAS-2是一个P缺失和干旱诱导型启动子。

图5 PBI101-pCPA-FAS-2转基因拟南芥的GUS定量分析 注: Phosphate starvation为P缺失诱导条件; PEG6000为模拟干旱诱导条件 Figure 5 GUS quantitative assay of PBI101-pCPA-FAS-2 transformed Arabidopsis Note: Phosphate starvation is the phosphate deficiency induced condition; PEG6000 is simulated drought inducement

2讨论
由于植物油广泛应用于食品加工业及工业生产等相关领域，而利用脂肪酸代谢途径中的一些关键基因可以定向富集特定的脂肪酸种类，从而改善油的品质并满足工业生产的特殊需要，因此对于植物脂肪酸代谢途径的研究一直是生物研究中的热点。虽然利用大肠杆菌的相似序列已经获得了一些植物的环丙烷合酶基因(Bao et al., 2002; Bao et al., 2011)，但是对这类基因的启动子研究还未见报道。基因启动子是重要的调控元件，通过了解启动子的调控特征不仅有助于分析基因的功能，而且一些具有特殊表达模式的启动子更可应用于转基因育种。所以，有关启动子的研究是基因功能研究必不可少的部分。

由于三碳碳环脂肪酸具有特殊理化性质，因此环丙烷脂肪酸在工业领域有良好的应用前景。而棉籽油是消费最多、最广的含有三碳碳环脂肪酸的植物油，对棉花环丙烷合酶基因的深入研究将会促进棉籽油在生产中的应用，提高棉花的应用价值(Liu et al., 2012)。本研究利用染色体步移克隆了棉花环丙烷脂肪酸合酶基因CPA-FAS-2的启动子序列，对其进行了生物信息学分析，发现该段区域含有一些器官特异性表达元件，如种子特异表达元件、根特异元件和花器官特异元件。这些预测结果与GUS染色结果较为一致，通过GUS组织化学染色，在根、花器官、种子以及茎基部观察到染色信号，说明CPA-FAS-2在植物的这些部位表达。香苹婆的环丙烷脂肪酸合酶基因也在种子中表达，叶片中不表达(Bao et al., 2003)。此外，pCPA-FAS-2的表达与发育时期密切相关，它只在生长发育后期即生殖发育期表达，而在幼苗期不表达，说明这类启动子不仅具有器官表达差异性还与发育时期密切相关。在CPA-FAS-2的启动子区发现了磷(P)和硫(S)缺失诱导元件，而一般认为环丙烷脂肪酸基因的底物是S-腺苷甲硫氨酸和含有不饱和脂肪酸的磷脂，所以P和S的含量对环丙烷脂肪酸基因的表达活性有重要影响(Bao et al., 2002)。通过GUS定量也证明了pCPA-FAS-2是一个P缺失诱导型启动子，说明棉花的CPA-FAS-2基因表达量与P含量密切相关。

诱导型以及具有器官表达差异的启动子对转基因育种意义重大，如根特异启动子可以应用于抗土传病害育种(Huang et al., 2006)，耐盐碱等胁迫育种，提高植物的抗逆能力(Gao et al., 2011)。种子特异启动子更可以用来进行种子营养等成分的改良(Wirth et al., 2009)。本研究分析了植物环丙烷脂肪酸基因启动子的特征，对该类基因功能的研究与转基因应用具有一定的借鉴意义。

3材料与方法
3.1材料
棉花品种为陆地棉(Gossypium hirsutum)柯字棉312，拟南芥品种为哥伦比亚型。棉花与拟南芥都在培养箱中生长。光周期为白天夜晚16 h/8 h，湿度为65%，光照度为7 000 Lx。

3.2棉花环丙烷脂肪酸合酶基因CPA-FAS-2启动子序列的克隆
根据网上登录的棉花环丙烷脂肪酸合酶基因CPA-FAS-2 (GenBank登陆号为: AAT74601)设计了3条特异引物(5’-GAAGGAAAATATCACTGGTAGCATA-3’; 5’-ACATATAGGAGCCAGGTAAGTGTTT-3’; 5’-TTTTATCCCACCTCCGATCACCGCC-3’)用来获得基因的5’侧翼区。利用CTAB法提取棉花叶片的基因组DNA (Paterson et al., 1993)，染色体步移方法参照clontech公司的GenomeWalkerTM试剂盒并按试剂盒说明书进行操作。

3.3构建CPA-FAS-2启动子序列与GUS基因融合的重组载体与拟南芥转化
根据获得的3.2 kb片段，设计引物pCPA-FAS-2-HindⅢ：5’-CGAAGCTTGGTCGAGTGAGATGAAGTACATCAT-3’和pCPA-FAS-2-BamHⅠ：5’-CCGGATCCGGATCCCACCTCCGATCACCGCCACT-3’, 引物中引入HindⅢ和BamHⅠ的识别位点。用该对引物扩增柯字棉312基因组DNA，PCR产物测序验证后用HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切，与经相同酶切后的植物表达载体pBI101.1 (Clontech公司)连接。将构建好的植物表达载体命名为pBI-pCPA-FAS-2::GUS，转化农杆菌LBA4404。利用粘花法转化拟南芥(Clough and Bent, 1998)。在40 mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上筛选转基因植株。

3.4 GUS活性的组织化学定位分析
用T₁代植株进行GUS活性的组织化学定位分析，分别取含有2片真叶的幼苗期，开花期以及成熟期拟南芥全株进行染色。方法参照Jefferson等(1987)的荧光组织化学定位法。染色结束后在体式解剖镜下镜检并拍照。

3.5 GUS定量分析
转基因拟南芥植株播种于1/2MS培养基上，当长出3~4片真叶时移至P缺失培养基上，P缺失培养基为用KCl替代KH₂PO₄的1/2MS培养基(Bournier et al., 2013)。PEG6000的处理条件为将3~4片真叶的植株移至含有15% PEG6000的1/2MS培养基中(Sun et al., 2013)。利用荧光定量法检测GUS基因活性，取转基因拟南芥根约0.1 g用液氮研磨，加入GUS提取缓冲液中(50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0), 0.1% Triton X-100, 10 mmol/L β-巯基乙醇, 10 mmol/L EDTA以及0.1% SDS)，4℃离心收集上清粗酶液。取适量粗酶液加入到反应缓冲液(含50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0), 0.1% Triton X-100, 10 mmol/L β-巯基乙醇, 10 mmol/L EDTA, 0.1% SDS, 5 mmol/L 4-MUG)中充分混匀，于37℃温育反应。用0.2 mol/L Na₂CO₃终止反应。用SHIMADZU RF5301PC荧光光度计测定产物中4-MU的含量。

3.5序列的生物信息学分析
利用网上数据库PLACE软件对棉花环丙烷脂肪酸合酶的启动子序列进行调控元件分析(Higo et al., 1999)。软件DNAMAN进行序列比对，Primer 5进行引物设计。

作者贡献
 杨郁文和方先文是本研究的实验设计和实验研究的执行人；陈天子和刘廷利完成数据分析，论文初稿的写作；朱伟参与实验设计和试验结果分析；张保龙是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由江苏省自主创新项目(CX(11)1020)和江苏省支撑科技支撑计划(BE2012337)共同资助。

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