韩国粉 , 张志宏 , 马跃 , 李贺 , 刘月学 , 代红艳

沈阳农业大学园艺学院, 沈阳, 110866
作者    通讯作者
《分子植物育种》印刷版, 2014 年, 第 12 卷, 第 22 篇   doi: 10.13271/j.mpb.012.000363
收稿日期: 2013年07月15日    接受日期: 2013年11月17日    发表日期: 2014年01月22日

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TA克隆载体由于能够用于PCR产物的快速克隆，且操作简单，因此被广泛应用。本研究的目的在于构建一种可以直接连接PCR产物的TA克隆植物表达载体，其在植物细胞中表达的筛选基因为nptⅡ。首先我们向植物表达载体pRNAi-BKI1 中引入包含2个XcmⅠ酶切位点的TA克隆位点序列，然后对pRNAi-BKI1载体原有的3个XcmⅠ酶切位点逐一进行定点突变，最终获得了以nptⅡ为筛选基因的TA克隆植物表达载体，命名为pTO。用XcmⅠ酶切pTO载体，得到两端含有T末端的线性载体，该线性载体可以直接与PCR产物连接。为了验证pTO载体的有效性，本研究利用PCR技术从pRI 201-AN-GUS载体上扩增GUS基因全长序列，将GUS基因连接到pTO载体上，构建出GUS基因的过表达载体 pTO-GUS。将pTO-GUS导入根癌农杆菌EHA105，并进行烟草叶片转化。利用GUS组织染色法对侵染后的烟草叶片进行GUS瞬时表达分析，结果显示pTO-GUS上的GUS基因在烟草细胞中高效表达。本研究获得的pTO载体适合用于构建目的基因的过表达载体，可以直接连接PCR产物，节省载体构建的步骤和时间。

TA克隆载体；nptⅡ；定点突变；XcmⅠ