茄子属于茄科(Solanaceae)茄属(Solanum)一年生草本植物，是中国重要的蔬菜作物之一。种子纯度表示品种典型一致性的程度，即样品中待测品种种子数或株数占供检样品种子总粒数或总株数的百分比(颜启传, 2001, 中国农业出版社, pp.355-356)。纯度鉴定是种子生产工作中不可或缺的重要步骤，是衡量种子质量的重要指标，是准确评定种子分级的主要根据，是保证优良品种增产潜力得以发挥的关键因素。目前对于茄子种子的纯度鉴定，特别是商业化的杂种一代种子进行鉴定主要还是依赖于田间的形态学鉴定，但这种方法所需时间长(一般需30~50 d)，而且容易受到环境条件的限制，周期长，用地多，且结果可靠性不高(王利英等, 2012)。因而，寻求新的更有效、更准确、更快速的纯度鉴定方法成为目前茄子种子生产急需解决的一个难题。

随着DNA分子标记技术的不断发展，分子标记在茄子遗传连锁图谱构建、遗传多样性分析以及育种研究中发挥着重要作用，并有效地促进了茄子分子育种和种子检测技术的全面发展(吴雪霞等, 2011)。其中，SSR标记具有数量丰富，稳定性、重复性以及多态性高，操作简单，常为共显性遗传，结果可靠性高，且对DNA质量要求较低等特点，在作物指纹图谱构建、遗传多样性分析以及纯度鉴定等工作中备受重视(Kantety et al., 2002)。目前SSR标记作为一种简单、快速的种子纯度鉴定方法而被广泛利用，已成功应用于油菜(宋贤勇等, 2010; 孟倩等, 2013)、小麦(王立新等, 2010)、水稻(汪爱顺等, 2005; 查仁明等, 2012)、玉米(谭君和杨俊品, 2009)、大白菜(杨晓云等, 2013)等作物种子纯度的鉴定，是目前备受科研人员和种子生产检测部门欢迎的一种种子检测方法。

在利用分子标记进行种子纯度鉴定过程需要的种子样本量一般在200粒以上，DNA提取的工作量很大，而传统的CTAB与SDS法步骤相对繁琐，严重地制约了SSR技术鉴定种子纯度的速度。SSR技术能得到普及和推广，DNA快速提取技术是关键，目前国内外学者已经研究出一些简便、快捷的DNA提取技术(Stein et al., 2001; 郭景伦等, 2005; 闫米格等, 2011)，其中NaOH裂解法因步骤相对简单，提取效率高，可以在短时间内提取大量样本DNA而普遍用于种子纯度以及转基因检测(谭君和杨俊品, 2009; 宋尚新等, 2010)。
 
本研究以本单位育成的“苏崎3号”、“苏崎4号”茄子为材料，通过改良NaOH裂解法快速提取植株DNA，利用SSR分子标记技术，筛选出双亲互补，特异性强、稳定性高的SSR引物，建立茄子杂交种种子纯度的鉴定方法，为茄子杂交种纯度鉴定提供理论基础和数据参考。

1结果与分析
1.1特征型引物的筛选
引物的筛选是SSR标记进行茄子杂交种纯度鉴定的一个关键的技术前提。本研究利用46对SSR引物分别对苏崎3号、苏崎4号父母本进行多态性筛选，其中3对引物在苏崎3号父母本中能扩增出互补的特异性谱带，4对引物在苏崎4号父母本中能扩增出特异性互补条带。根据各引物间谱带的清晰度、稳定性以及差异谱带间差异明显等特点，本研究选取引物emk04N11用于苏崎3号种子的纯度鉴定(图1)，引物emf11D18用于苏崎4号种子的纯度鉴定(图2)。

图1 引物emk04N11对“苏崎3号”及其亲本的扩增结果 注: 1: 母本EP7; 2: 父本EP4; 3: 苏崎3号 Figure 1 Banding pattern of primer emk04N11 for “Suqi 3”and their parents Note: 1: Maternal parent EP7; 2: Paternal parent EP4; 3: Suqi 3

图2 引物emf11D18对“苏崎4号”及其亲本的扩增结果 注: 1: 父本EP5; 2: 母本EP16; 3: 苏崎4号 Figue 2 Banding pattern of primer emf11D18 for “Suqi 4”and their parents Note: 1: Paternal parent EP5; 2: Maternal parent EP16; 3: Suqi 4

1.2纯度鉴定
利用SSR引物emk04N11对200个“苏崎3号”杂交种进行SSR检测，对比茄子杂交种以及父本、母本的谱带特征，统计出“苏崎3号”杂交种样品中具有双亲互补带的植株数量和只具有母本带型的假杂种数量。通过电泳结果显示，“苏崎3号”的种子纯度为97.5% (图3)。利用emf11D18对随机选取的200个“苏崎4号”杂交种单株进行SSR检测，结果显示其纯度为98.5% (图4)。

图3 引物emk04N11在部分“苏崎3号”单株以及亲本中的扩增结果 注: ♀: EP7; ♂: EP4; 1~7,9~11,13~23: “苏崎3号”部分单株; 8,12: 自交株 Figure 3 Banding pattern of primer emk04N11 for “Suqi 3” and their parents Note: ♀: EP7; ♂: EP4; 1~7,9~11,13~23: Individual plants of “Suqi 3” ; 8,12: Sselfing plants

图4 引物emf11D18在部分“苏崎4号”单株及其亲本中的扩增结果 注: ♀: EP16; ♂: EP5; 1~6,8~12,14~23: “苏崎4号”部分单株; 7: 缺失; 13: 自交株 Figure 4 Selected SSR maps of “Suqi 4” verified by primer emf11D18 Note: ♀: EP16; ♂: EP5; 1~6,8~12,14~23: Individual plants of “Suqi 4”; 7: Lost; 13: Selfing plant

1.3田间种植鉴定
通过大田种植，根据植株株型表现鉴定，在300株“苏崎3号”群体中，有5株表现为直立生长，叶色较淡，节间长，其植株株型表现与母本一致，为母本自交株，纯度为98.5%。300株“苏崎4号”群体中，有3株表现为植株矮小，株型开展，萼刺较多，其株型特征与母本一致，为假杂株，其纯度为99%。

2讨论
目前茄子杂交种主要的鉴定方法有田间形态学鉴定法和生化检测法等，但形态学鉴定法易受到环境条件的限制，周期长，耗费大，且结果可靠性不高，生化检测技术操作过程复杂，费事费钱，都存在一定的局限性，不能满足种子纯度鉴定和育种工作发展的需要。随着分子标记技术的发展，将逐步替代形态学标记被用于良种质量检测。基于DNA水平上样本间差异的SSR分子标记技术，可以在茄子苗期甚至种子阶段进行，具有准确度高、分辨力强、不受基因表达和环境条件的影响、稳定性与可操作性比其他分子标记以及同工酶检测高等优点(梅眉和陆璐, 2005)。

目前，限制茄子纯度鉴定分子标记检测效率的主要因素是基因组DNA提取过程略显繁琐。本研究在禾本科DNA快速提取技术的基础上，首次将NaOH裂解法运用到茄子DNA提取中，与传统的CTAB法进行比较，虽然NaOH裂解法提取的DNA中蛋白质和杂质含量较高，通过琼脂糖电泳并不能明显看到DNA条带，而且提取的茄子DNA中有2%~4%的样本不能正常扩增，导致条带缺失，但SSR标记对DNA质量要求不高。利用该模板进行PCR扩增，得到的PCR产物经电泳检测后，条带清晰度与传统的CTAB法相差不大。另外，由于种子纯度鉴定中样本量相对较大，未能成功提取到样本数相对较少，因此对纯度鉴定结果无影响。鉴于纯度鉴定材料繁多，采用NaOH裂解法能够简化提取程序，节省大量时间，又避免了氯仿等易挥发且毒性较强试剂造成的危害，可用于茄子DNA的快速提取。

本研究从46对SSR引物中筛选出emk04N11和emf11D18引物分别用于“苏崎3号”和“苏崎4号”种子的纯度鉴定。结果表明，两个杂交种的纯度分别为97.5%和98.5%，其结果与田间鉴定结果相似，说明SSR标记能够有效地鉴定出假杂种，可用于茄子杂交种鉴定。而且从电泳图上和田间鉴定结果显示，杂株条带均为偏母本的条带，田间植株表型也与母本株型一致，也就是说假杂种均为母本自交株。这就给制种工作者以启示，在制种过程中，母本的去雄工作要及时、干净，防止母本自交所带来的假杂种，以提高种子的质量。本研究建立起的纯度鉴定方法，对进行茄子杂交种高通量分析的纯度鉴定工作具有指导意义。但是，随着优秀茄子种质资源遗传范围的逐渐变窄，目前茄子开发的SSR标记量并无法保证在所有材料上筛选到合适的引物，进一步加强茄子SSR标记的开发与品种指纹图谱构建，建立核心SSR引物资源库，将有利于该方法的进一步推广与运用。

3材料与方法
3.1材料
供试材料为茄子杂交品种“苏崎3号”及其父本EP4、母本EP7，和“苏崎4号”及其父本EP5、母本EP16，所有材料由江苏省农业科学院蔬菜作物研究所茄子研究项目组提供。

3.2方法
3.2.1 DNA提取
本研究参照目前在水稻、玉米等大田作物上常用的DNA快速提取法(NaOH裂解法)提取茄子植株DNA (田再民等, 2009; 吴向远等, 2012)。取刚发芽1~ 2 cm的嫩茎放到1.5 mL离心管底部，加入0.1 mol/L的NaOH溶液150 μL，在自动磨样机上快速研磨至匀浆无大片组织即可；摇匀，煮沸8 min；再加入150 μL pH=2的TE溶液，摇匀，煮沸2 min。将离心管拿出放于冰上冰浴，10 000 r/pm离心3 min，取上清即可。其中用于引物筛选的亲本材料DNA利用常规CTAB法进行提取。

3.2.2 SSR标记鉴定
本研究所用的46对SSR引物序列参照Nunome等(2009)已公布的SSR序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。SSR扩增反应体系参照Nunome等(2009)的方法并略作调整，整个反应体积为20 μL，各组分为10×PCR Buffer (含mg²⁺) 2 μL，1.6 μL dNTPs (2.5 mmol/L, each)，SSR上、下游引物(10 pmol/L)各0.4 μL，2 μL模板DNA，Taq酶1 U。SSR扩增热循环参数为：94℃预变性3 min，然后94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，共35个循环，最后72℃延伸7 min。扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，0.5%硝酸银染显色，并观察拍照统计结果(许绍斌等, 2002)。

3.2.3田间种植鉴定
2013年4月至2013年6月，在江苏省农业科学院六合基地进行田间种植鉴定。将“苏崎3号”和“苏崎4号”种子分别按株行距40 cm×40 cm进行种植，各种植300株。在门茄“瞪眼期”，通过观察统计各植株的农艺性状，根据父、母本与杂交种的株型、叶色、花期和果型等进行田间纯度鉴定。将SSR鉴定结果与田间种植鉴定结果进行比对，验证SSR标记鉴定的有效性。

作者贡献
刘军和庄勇是本研究的实验设计和实验研究的主要执行人；刘军完成数据分析，论文初稿的写作；周晓慧参与实验设计，试验结果分析；庄勇是项目的构思者及负责人，指导试验设计、数据分析、论文写作，确定修改及定稿。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由江苏省农业科技自主创新资金(CX(13)- 2003)和江苏省自然科学基金(BK2011675)共同资助。

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