烟草青枯病是威胁世界烟草生产的一大毁灭性病害(朱贤朝等, 2002)。烤烟品种主要在大田中后期发病，河南、山东、江苏、云南、广西、河北、湖南、广东和福建等地曾普遍发生(陈瑞泰等, 1997; 孔凡玉, 2003; 顾钢等, 2002)，每年都给感病区的烤烟生产造成巨大损失。近几年来，烟草青枯病虽未大面积流行，但局部地区发病依然严重，且常与烟草黑胫病混合发生，严重时可致全田烟草枯死，给烟农带来巨大的经济损失(刘勇等, 2007; 孙光军等, 1999, 烟草科技, (5): 48)。因此，烟草的产业化发展，急需预防和解决青枯病害，尤其重视和加强烟草抗青枯病安全育种研究。

随着功能基因组学的发展，转基因技术在农业生产上得到不断探索和尝试，而优异候选基因的确定是实现该过程的前提和基础。研究表明，构建全长cDNA文库，是发现和确定候选基因的有效手段。通过建立不同种质在逆境诱导、不同发育时期以及不同组织器官的cDNA文库，可以有效的分离克隆与烟草生长、发育、抗逆、抗病、品质等有关基因的全长序列、调控因子以及特异启动子，进一步研究其表达模式，并进行基因表达产物分析、转基因功能验证及生理遗传学分析。对于确定基因功能，进而分析这些基因在烟草遗传改良中的利用价值和途径具有重要意义。

目前，烟草全长cDNA文库已相继有报道(高健等, 2004; 张锦伟等, 2005; 崔红等, 2006; 龚达平等, 2012; 蔡铁城等, 2012; 曾建斌等, 2012)，建立烟草全长cDNA文库，获得大量的EST (expression sequence tags)和全长cDNA序列是开展烟草功能基因研究的重要前提。对烟草功能基因表达谱进行分析是深入研究烟草基因作用网络的基础，通过建立全基因组高质量的全长cDNA数据库，不仅可以获得功能基因的实体拷贝，而且能够提供基因的转录调控、剪接方式和启动子等信息(谢卡斌等, 2005, 中国科学C辑: 生命科学, 35(1): 6-12)。此外，还可以对蛋白质序列进行预测，进行体外表达以及通过反向遗传学研究基因的功能等(谢卡斌等, 2005, 中国科学C辑: 生命科学, 35(1): 6-12)。

为充分开发和利用烟草珍贵种质资源，尤其是挖掘特异种质在抗病中的潜力，本研究选用高抗青枯病烤烟品种K326，经强致病力青枯菌菌株注射法接种叶片，接种后不同时期取样，利用Clontech公司的SMART技术成功构建了受青枯菌诱导的烟草叶片混合全长cDNA文库，并随机测序了50个文库单克隆，对测序成功的序列进行Blast2Go分析。为进一步分离、筛选和克隆青枯菌诱导烟草叶片胁迫相关基因以及对烟草功能基因组学的研究打下基础。

1结果与分析
1.1总RNA的纯度及完整性检测
 经过改良的CTAB-LiCl法提取烟草青枯菌处理和对照叶片的总RNA (图1)，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测可看出，提取的总RNA中28S rRNA和18S rRNA条带清晰，基本具有2:1的比例关系，经过Nanodrop测定浓度后A260/A280比值平均在1.80~ 2.0之间，A230/A260比值在2.0以上，表明我们提取的RNA纯度很高，质量较好，完全符合构建文库的要求。

图1 接种青枯菌后烟草叶片总RNA电泳图 注: M: DL2000 maker; 1: 青枯菌处理叶片RNA; 2: 对照叶片RNA Figure 1 Electrophoresis of total RNA Note: M: DL2000 maker; 1: Total leaf RNA inoculated of Ralstonia Solanacearum; 2: Total leaf RNA inoculated of ddH2O

1.2 ds cDNA的合成及鉴定
取大约3 μg青枯菌处理和对照混合总RNA进行逆转录反应，dscDNA采用LD-PCR反应合成。合成的dscDNA产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测(图2)，合成的混合dscDNA片段主要分布于500~5 000 bp之间，并且呈非常均匀的smear带，这说明双链合成的质量较高，效果较好，能够满足全长cDNA文库构建的需要。

图2 dscDNA电泳图 注: M1: DL2000 marker; M2: DL15000 marker; 1: 青枯菌处理dsDNA; 2: 对照dsDNA Figure 2 Electrophoresis of double-stranded cDNA Note: M1: DL2000 marker; M2: DL15000 marker; 1: dscDNA of treated samples; 2: dscDNA of control

1.3文库质量的鉴定
双链经酶切、胶回收、连接载体、电击转化、涂板过夜培养后，计数培养板单克隆数，原始文库滴度为1.902×10⁶ cfu/mL。随机挑取15个单菌落摇菌，进行菌液PCR扩增结果,如图3所示，重组率达99%。提取质粒酶切后电泳如图4显示，插入片段大小主要集中在0.75~2.5 kb之间，平均长度约1.3 kb。重组率及插入片段大小均达到全长cDNA文库质量要求。

图3 受青枯菌诱导的烟草叶片全长cDNA文库菌液PCR电泳图 注: 1~15: cDNA插入片段; M1: DL2000 marker Figure 3 PCR detection of inserted sizes from cDNA library Note: 1~15: Inserts of cDNA; M1: DL2000 marker

图4 受青枯菌诱导的烟草叶片全长cDNA文库单菌落质粒酶切电泳图 注: 1~10: 单克隆质粒酶切结果; M1: DL15000 marker; M2: DL2000 marker Figure 4 Electrophoresis of plasmid enzyme digestion Note: 1~10: Plasmid digestion of the clone; M1: DL15000 marker; M2: DL2000 marker

1.4文库的小批量测序及其生物信息学分析
Blast2Go是一个基于序列相似性搜索进行功能注释的生物信息学软件，能够对大批量序列进行GO注释和功能分析，并统计基因参与的生物过程、细胞组分以及分子功能信息(Conesa et al., 2005; Buza et al., 2008)。我们从文库中随机挑选50个单克隆进行测序分析，用测序引物进行双向测序。序列经拼接，去掉引物及载体序列后获得完整序列43条，Blast2Go分析结果统计显示，分子功能中参与最多的是结合(包括离子结合, ATP结合等)，其次是分子结构活性(图5)。少量测序表明，这些基因参与不同的生物学过程，文库基因资源较丰富，可用于后续深入发掘与利用烟草抗青枯病相关基因。

图5 Blast2Go分析参与的分子功能分布 注: a: 结合; b: 转移活性; c: 电子传递活性; d: 分子结构活性; e: 催化活性; f: 转录因子活性; g: 酶调控活性 Figure 5 Distribution of molecular function by Blast2Go Note: a: Binding; b: Transpoter; c: Electron carrier activity; d: Strustual molecular activity; e: Catalytic activity; f: Transcription factor activity; g: Enzyme regulator activity

2讨论
SMART技术是一种被广泛运用于文库构建的技术之一(Zhu et al., 2001; Wellenreuther et al., 2004)，该技术较为成熟，并已由Clontech公司开发出试剂盒。由于该技术具有起始RNA量少、全长cDNA和长片段的cDNA含量高和基本无rRNA污染的特点，代表性好，已广泛应用于动植物学、微生物学和医学研究领域(Skiba et al., 2005; 宋晓宏和沙伟, 2009; 王家保等, 2009)。全长cDNA文库由于包括了5'UTR (untranslated regions)和3'poly (A)，为克隆基因的全长序列提供了便利，已较多运用于植物生物与非生物胁迫研究中。如Tian等(2003)应用SMART技术构建了一个富集晚疫病抗性相关基因的全长cDNA文库，从中得到一个新的马铃薯病程相关蛋白基因。李广存(2006)构建了受青枯菌诱导的马铃薯全长cDNA文库，获得了许多防卫相关基因。启示构建抗病全长cDNA文库，克隆抗病相关基因是可行的。然而，大多数的抗病基因都是RGH (resistance gene homolog)，这类其基因序列往往较长。这就要求cDNA文库在满足全长率的基础上，尽可能提高大片段插入率。本研究对传统构建cDNA文库的步骤进行相应的优化，即将胶回收片段方法替代了片段分级分离的方法。本研究所构建的受青枯菌诱导的烟草叶片混合全长cDNA文库，初级文库滴度达到1.902×10⁶ cfu/mL，重组率为99%，插入片段大小多在0.75~2.0 kb之间，平均大小在1.3 kb左右。同时满足了文库重组率和大片段比例，可见本研究所构建文库已达到预期的目标。

全长cDNA文库的构建是克隆目标基因的基础，必需结合大规模的EST测序和文库筛选的办法。本研究随机挑选部分克隆进行小规模测序，结果显示基因信息还是十分有限。因此，后续还需利用网上已有的抗病基因资源，设计相应探针，对文库进行筛选，抑或扩大测序规模。深入挖掘和开发利用本文库的基于资源，克隆获得与烟草受青枯菌诱导相关的胁迫基因，并进行表达分析和后续的功能验证，最终服务于烟草抗青枯病的安全育种。

3材料和方法
3.1材料
实验选用高抗青枯病优质烤烟品种K326，栽培于福建省作物细胞与分子生物学重点实验室温室。采用叶片注射接种方法，剂量为每片注射10 μL浓度为109的青枯菌菌液，分别在注射12 h，24 h，3 d，6 d和12 d后分别取样。以接种无菌水为对照，对应时间点同时取样，迅速于液氮中冷冻，-80℃保存备用。

文库构建试剂盒(Creator^TM SMART^TM cDNA Library Construction Kit)购自Clontech公司；Ex-Taq酶，PrimerScript逆转录酶，RNaseI抑制剂，dNTP，DL2000及DL15000分子标准均购自大连宝生物公司(TAKA- RA)；电转化感受态细胞DH5α来自本实验室；其它试剂均采用国产分析纯。

3.2文库的构建
K326烟草品种叶片经青枯菌接种(处理组)和无菌水注射(对照组)不同时间点分别取样，以处理组和对照组两个样本为为材料，采用改良的CTAB-LiCl法提取总RNA (杨冬青等, 2011)，DNaseⅠ处理后检测总RNA浓度以及纯度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。提取RNA后，并等量混合，以3 μg总RNA为模板按照Creator^TM SMART^TM cDNA Library Construction Kit说明书(Zhu et al., 2001)以SMART Ⅳ Oligonucleotide和CDS Ⅲ/3'PCR Primer合成cDNA第一链，然后以3'PCR Primer和5'PCR Primer为引物通过LD-PCR合成双链cDNA。双链cDNA经蛋白酶K处理后sfiⅠ酶切，胶回收750 bp以上片段。与质粒载体 pDNR-LIB连接经电击转化37℃培养1 h后得到原始全长cDNA文库菌液。

3.3文库质量的鉴定
将原始文库菌液吸取1 μL菌液加入到99 μL液体LB培养基中，混匀后涂含氯霉素(30 mg/L)的LB平板，37℃过夜培养，计数单克隆数，根据公式：文库的滴度计算公式cfu/mL=长出菌落数×稀释倍数×10³/稀释的菌体涂板体积(μL)，计算原始文库量。随机挑取25个单菌落，以M13F和M13R引物进行菌液PCR验证，1%的琼脂糖凝胶电泳检测文库插入率；另随机挑选15个单菌落摇菌后提取质粒，SfiⅠ (A&B)酶切，琼脂糖电泳检测插入片段大小。

3.4文库的扩增
其余原始文库菌液涂含氯霉素(30 mg/L)的LB平板，经37℃过夜培养，用液体LB培养基洗脱平板所得的菌液，加入终浓度为25%的甘油混匀后分装保存于-80℃冰箱，即为扩增文库。扩增文库菌液按10³、10⁴、10⁵、10⁶和10⁷梯度稀释后，统计单克隆数，参照扩增文库的总库容=单克隆数×稀释倍数×10³×10³，换算扩增文库总库容。

3.5文库的随机测序以及Blast2go生物信息学分析
随机挑取50个单菌落做穿刺Stock并送至深圳华大基因公司进行双向测序，并对测序结果去除载体和引物等冗余序列后，拼接成完整序列，利用Blast2Go (http://www.blast2go.com/b2ghome/)软件对所获得的基因序列进行生物统计学分析。

作者贡献
张冲和蔡铁城是本研究的实验设计和实验研究的执行人；张冲完成数据分析，论文初稿的写作；曾建斌、陈华参与部分实验研究；庄伟建是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国烟科(2006)371、闽烟科(2008)13和福建省作物分子与细胞生物学重点实验室项目(2008-J1033)共同资助。

参考文献
Buza T.J., McCarthy F.M., Wang N., Bridges S.M., and Burgess S.C., 2008, Gene ontology annotation quality analysis in model eukaryotes, Nucleic Acids Res., 36(2): e12

Cai T.C., Zeng J.B., Chen S.H., Chen H., He X.Y., Zhang C., and Zhuang W.J., 2012, Construction of tobacco stem full-length cDNA library with SMART technique, Fujian Nonglin Daxue Xuebao (Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition)), 40(1): 53-57 (蔡铁城, 曾建斌, 陈顺辉, 陈华, 贺小彦, 张冲, 庄伟建, 2012, 利用SMART技术构建烟草茎全长cDNA文库, 福建农林大学学报(自然科学版), 40(1): 53-57)

Chen R.T., Zhu X.C., Wang Z.F., Guo Z.Y., Dong H.S., Wang L.Z., Liu Y.R., and Shi J.K., 1997, A report of investigating and studying tobacco infectious diseases of 16 main tobacco producing provinces (regions) in China, Zhongguo Yancao Kexue (Chinese Tobacco Science), 1(4): 1-7 (陈瑞泰, 朱贤朝, 王智发, 郭振业, 董汉松, 王兰珍, 刘延荣, 石金开, 1997, 全国16个主产烟省(区)烟草侵染性病害调研报告, 中国烟草科学, 1(4): 1-7)

Conesa A., G?觟tz S., García-Gómez J.M., Terol J., Talón M., and Robles M., 2005, Blast2go: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research, Bioinformatics, 21(18): 3674-3676

Cui H., Ji H., Zhang H., and Chen L., 2006, Construction of full-length cDNA library from trichomes of Nicotinan Tabacium, Xiamen Daxue Xuebao (Journal of Xiamen University (Natural Science)), 45(6): 859-862 (崔红, 冀浩, 张华, 陈亮, 2006, 烟草腺毛全长cDNA文库的构建, 厦门大学学报(自然科学版), 45(6): 859-862)

Gao J., Xu X.F., Wu H.L., Chen X.L., and Zhou J.H., 2004, Construction of full-length cDNA library from a native tobacco germplasm and its quality analysis, Anhui Nongye Daxue Xuebao (Journal of Anhui Agricultural University), 31(1): 22-25 (高健, 许晓风, 乌慧玲, 陈学平, 周家昊, 2004, 特异种质烟草全长cDNA文库的构建及质量分析, 安徽农业大学学报, 31(1): 22-25)

Gong D.P., Xie M.M., and Sun Y.H., 2012, Construction and sequences analysis of full-length cDNA library of tobacco leaves, Zhongguo Nongye Kexue (Scientia Agricultura Sinica), 45(9): 1696-1702 (龚达平, 解敏敏, 孙玉合, 2012, 烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析, 中国农业科学, 45(9): 1696-1702)

Gu G., Ji C.C., Fang S.M., and Chen S.H., 2002, The resistive reactions of the major tobacco cultivars to bacterial wilt, Yunnan Nongye Daxue Xuebao (Journal of Yunnan Agricultural University (Natural Science)), 17(2): 130-133 (顾钢, 纪成灿, 方树民, 陈顺辉, 2002, 烟草主栽品种对青枯病抗性反应, 云南农业大学学报(自然科学版), 17(2): 130-133)

Kong F.Y., 2003, Integrated control of tobacco bacteria wilt disease, Yancao Keji (Tobacco Science & Technology), (4): 42-43, 48 (孔凡玉, 2003, 烟草青枯病的综合防治, 烟草科技, (4): 42-43, 48)

Li G.C., 2006, Isolation of resistance related genes to Ralstonia Solanacearum and their function analysis in diploid potato, Dissertation for Ph.D., Chinese Academy of Agricultural Sciences, Supervisor: Qu D.Y., pp.70-79 (李广存, 2006, 马铃薯青枯病抗性相关基因的分离及其功能分析, 博士学位论文, 中国农业科学院, 导师: 屈冬玉, pp.70-79)

Liu Y., Qin X.Y., Wang M., Liu Y.J., Zhu M.L., Ji G.H., and Zhang S.R., 2007, The disease survey and pathogen isolation of tobacco bacterial wilt in Yunnan province, China, Zhongguo Nongxue Tongbao (Chinese Agricultural Science Bulletin), 23(4): 311-314 (刘勇, 秦西云, 王敏, 刘月静, 祝明亮, 姬广海, 张世荣, 2007, 云南省烟草青枯病危害调查与病原菌分离, 中国农学通报, 23(4): 311-314)

Skiba B., Ford R., and Pang E.C.K., 2005, Construction of a cDNA library of Lathyrus sativus inoculated with Mycosphaerella pinodes and the expression of potential defence-related expressed sequence tags (ESTs), Physiol. Mol. Plant P., 66: 55-67

Song X.H., and Sha W., 2009, Application of cDNA library in research of plant drought resistance mechanism, Shengwu Jisshu Tongbao (Biotechnology Bulletin), (3): 57-60 (宋晓宏, 沙伟, 2009, cDNA文库技术在植物抗旱机制研究中的应用, 生物技术通报, (3): 57-60)

Tian Z.D., Liu J., and Xie C.H., 2003, Cloning of pathogenesis-related protein gene cdna of patato using race methods combined with cDNA library, Acta Genetica Sinica, 30(11): 996-1002

Wang J.B., Xu B.Y., Jin Z.Q., and Feng C., 2009, Constructing cDNA library of litchi pericarp using SMART technology, Redai Zuowu Xuebao (Chinese Journal of Tropical Crops), 30(8): 1109-1112 (王家保, 徐碧玉, 金志强, 冯超, 2009, 利用SMART技术构建荔枝果皮cDNA文库, 热带作物学报, 30(8): 1109-1112)

Wellenreuther R., Schupp I., and Poustka A., 2004, The German cDNA consortium SMART amplification combinedwith cDNA size fractionation in order to obtain large full length clones, BMC Genomics, 36(5): 1-8)

Yang D.Q., Wang Y.S., Sun M.L., Shan Y., Luo Y., Wei C.L., Gao L.P., and Xia T., 2011, A simple and effective method for extracting total RNA from different organs of tea plant [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze], Jiguang Shengwu Xuebao (Acta Laser Biology Sinica), 20(1): 108-115 (杨冬青, 王云生, 孙美莲, 单育, 骆洋, 韦朝领, 高丽萍, 夏涛, 2011, 茶树不同器官组织总RNA提取方法的研究, 激光生物学报, 20(1): 108-115)

Zeng J.B., Chen S.H., Chen H., He X.Y., Jiang B.J., Zhang C., Cai T.C., and Zhuang W.J., 2012, Construction of full-length cDNA library from leaf of quality tobacco varieties and its characterization, Zhongguo Yancao Xuebao (Acta Taba- caria Sinica), 18(1): 85-91 (曾建斌, 陈顺辉, 陈华, 贺小彦, 姜宝杰, 张冲, 蔡铁城, 庄伟建, 2012, 烟草优质品种叶片全长 cDNA文库的构建和质量分析, 中国烟草学报, 18(1): 85-91)

Zhang J.W., Li W.Z., and Tan X.L., 2005, Construction of cDNA library from excellent tobacco variety K326 with resistance to black stalk, Yunnan Nongye Daxue Xuebao (Journal of Yunnan Agricultural University), 20(6): 766-770 (张锦伟, 李文正, 谭学林, 2005, 抗黑胫病烟草品种K326 cDNA文库的构建, 云南农业大学学报, 20(6): 766-770)

Zhu X.C., Wang Y.T., and Wang Z.F., 2002, Tobacco diseases of China, China Agriculture Press, Beijing, China, pp.152-162 (朱贤朝, 王彦亭, 王智发, 2002, 中国烟草病害, 中国农业出版社, 中国, 北京, pp.152-162)

Zhu Y.Y., Machleder E.M., Chenchik A., Li R., and Siebert P.D., 2001, Reverse transcriptase template switching: a SMAR-TTM approach for full-length cDNA library construction, Biotechniques, 30(4): 892-897