在真核生物细胞有丝分裂和减数分裂过程中，着丝粒是保证染色体正确分离的关键元件(Palmer et al., 1987; Paweletz, 2001; 丁戈等, 2008; 裔传灯等, 2007)。研究表明着丝粒是由蛋白和DNA组成的复合体，但在具有功能的着丝粒中，蛋白发挥着更重要的作用(佘朝文和宋运淳, 2006; Furuyama and Biggins, 2007)。CENH3是功能着丝粒特异组蛋白，是传统组蛋白H3的变异型(Zhong et al., 2002; Yu et al., 2000; Hoopen et al., 2002; Talbert et al., 2002; Choo, 2001; Henikoff et al., 2001)。用CENH3抗体对着丝粒区域重复DNA序列进行染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitataion, CHIP)分析表明(李敏俐等, 2010)：玉米和水稻等植物的着丝粒特异DNA序列与CENH3发生相互作用，维持着丝粒功能(Nagaki et al., 2004; Jin et al., 2004)。由此可知，CENH3是真核生物着丝粒的根本特征，是植物染色质功能着丝粒的基本识别标记(佘朝文和宋运淳, 2006; Yan and Jiang, 2007)。

定位和观察CENH3在染色体上位置，可以判断染色体着丝粒的功能正常与否。目前染色体蛋白免疫荧光(immunofluorescence, IF)分析是定位相关蛋白在染色体上的具体位置的主要方法之一，特别适用于观察着丝粒的功能与位置(龚志云等, 2008)。但在IF分析中，如果实验过程中处理不当，蛋白质特别容易变性，而不能被相应抗体检测到，所以在IF分析中，材料的制备与处理非常关键(龚志云等, 2008)。一般情况下都会用新鲜的材料来制备染色体，但是新鲜材料的收集会受到季节和时间的限制，因此建立合适的材料制备方法对提高染色体蛋白免疫荧光检测的效率有重要意义。在对水稻根尖染色体进行蛋白免疫荧光检测的研究中，经常会发现细胞和染色体形态具有较深的背景，这些背景会覆盖或者减弱染色体原有的信号强度，进而影响CCD (Charge-coupled device)拍照，不利于荧光信号的检测(Gong et al., 2009)。而这些细胞和染色体周边的背景可能与根尖的预处理和保存方式有关。

本研究参照前人在其它作物的研究结果，利用PBS和甲醇两种不同的试剂处理与保存水稻根尖，并结合酶解的方法，制备水稻间期染色体细胞进行IF分析，以建立适合水稻IF分析的简易检测方法。

1结果与分析
1.1 4种不同处理方式对水稻根尖间期细胞制备的影响分析
本研究选用水稻单倍体材料T2037设计4种不同处理方式进行着丝粒蛋白CENH3的IF分析，并对不同组间期细胞形态和染色体CENH3信号进行了统计比较(表1; 图1)。

表1 T2037根尖材料在不同处理方式下间期细胞数及CENH3信号分布 Table 1 The number of interphase cells and the CENH3 signals by different treatments in T2037 root-tip material

图1 水稻T2037根尖细胞CENH3蛋白免疫鉴定分析 注: A: PBS保存处理; B:甲醇保存处理; C:酶解后PBS处理; D:酶解后甲醇处理; 图中染色体都以DAPI染色; 白色箭头所示为红色的CENH3信号, 黄色箭头所示为细胞质背景 Figure 1 Localization of CENH3 at interphase in T2037 Note: A: Preserved in PBS; B: Preserved in methanol; C: Preserved in PBS after enzymolysis; D: Preserved in methanol after enzymolysis; Chromosomes were counterstained with DAPI in all images; The white arrows indicated the red CENH3 signals, and the yellow arrows indicated the cytoplasm background

从表1的4组数据比较和分析可知，在经过PBS处理后没有进行酶解而直接进行染色体压片的A组材料中，随机观察100个细胞，并进行统计分析，发现在这100个细胞中，形态完整的间期细胞数目达到79.0%。进一步利用CENH3蛋白抗体对该100个细胞进行蛋白质免疫荧光检测(图1A)，在所观察的79个形态完整的间期细胞中有44个细胞可以观察到CENH3蛋白抗体检测信号(图1A)，检测率达55.6%。由于本研究中我们所用材料为水稻单倍体，所以一个完整的细胞中应该有12个检测信号。进一步对有检测信号的细胞中信号数目进行观察，其中可以清楚观察到12个信号数的间期细胞16个，占观察总细胞数的16%。

没有酶解的B组材料经过甲醇处理后直接压片，在荧光显微镜下随机观察的100个间期细胞，其中形态完整的间期细胞数目有74个，可以检测到CENH3蛋白抗体信号的有24个间期细胞，检测率达到32.4%。其中可以清楚的看到12个检测信号的间期细胞有10个(图1B)，占观察总细胞数的10%。

C组材料是在酶解后经过PBS缓冲液处理，再进行染色体制备。在观察的100个细胞中形态完好的间期细胞有87个，可以看到蛋白抗体检测信号的间期细胞有45个，检测率达到51.7%。其中达到12个信号数目的间期细胞有7个(图1C)，占观察总细胞数的7%。

酶解后固定在甲醇中的D组材料，在荧光显微镜下检测的100个间期细胞中，完整的间期细胞观察到93个，而观察到可见信号的间期细胞有47个，检测率为50.5%。其中有12个检测信号的间期细胞数目为0 (图1D)。

进一步分析细胞质背景发现，A组和B组材料中细胞质背景相对于C、D两组较浅(图1)，其中经过PBS缓冲液处理的A组材料比甲醇处理的B组相对要好，CENH3蛋白抗体检测信号也更清晰，信号数也更多(图1A; 图1B)；而经过酶解处理的C组和D组细胞质背景都较重(图1C和图1D中黄色箭头所示)，检测信号的强度较弱(图1C和图1D中白色箭头所示)，不利于观察和分析。

1.2不同分裂时期CENH3的染色体定位分析
利用第一种处理方式对常见细胞分裂类型进行IF分析。从图2可以看出，不同分裂时期染色体形态完整，无细胞质背景，其中图2A为间期细胞，图2B为前中期细胞，图2C为后期细胞。进一步用CENH3蛋白抗体对各分裂时期的细胞进行蛋白免疫荧光检测，在三个不同时期，检测信号明显，并且信号点数目和细胞所处时期的染色体数目相一致。在间期细胞中，可以检测到12个CENH3信号(图2A)；在前期细胞中，由于间期染色质复制使每一条染色体包含有两条姊妹染色单体，所以可以检测到24个CENH3信号(图2B)；在后期细胞中，由于姊妹染色单体分离，形成两个子细胞，在每一个子细胞中均含有12个CENH3信号(图2C)。在三个不同时期的细胞中，信号点所处的位置确实是染色体着丝粒所在的位置。

图2 PBS处理方式下不同分裂时期染色体形态及CENH3信号 注: A: 间期细胞; B: 中期细胞; C: 后期细胞; 图中染色体都以DAPI染色; MERGE: 表示合成图; DAPI: 表示由DAPI染色的染色体; CENH3: 表示着丝粒特异组蛋白CENH3的信号 Figure 2 The chromosomes and CENH3 signals in different periods of mitosis Note: A: Interphase cell; B: Prometaphase cell; C: Anaphase cell; Chromosomes were counterstained with DAPI in all images; MERGE: The combined images; DAPI: The chromosomes were counterstained with DAPI; CEN- H3: The CENH3 signals

由此可见，在水稻中，由第一种处理方式所建立的IF分析方法能够获得清晰的不同分裂时期细胞，并可以获得较好的进行染色体着丝粒定位效果。

2讨论
真核生物中着丝粒是染色体的基本元件。研究表明着丝粒是蛋白质和DNA的复合体，在这两者之中，蛋白质对染色体着丝粒功能的正常发挥起着关键性作用(Gong et al., 2009; 2012)。建立简单、重复性好的方法来鉴定着丝粒蛋白的存在与否是蛋白免疫荧光分析的重要内容之一。在本研究的前期预备实验中，参照前人在玉米，小麦中的研究结果(Koo et al., 2011; Zhang et al., 2008)，利用纤维素酶和果胶酶来处理水稻根尖细胞，发现未获得重复性好的水稻蛋白免疫检测方法。为了进一步建立水稻染色体蛋白免疫分析简单，重复性好的检测方法，本研究设计了四个不同处理方式。研究表明在对水稻根尖处理中，酶解后的根尖染色体没有未经酶解的效果好，而是有更深的细胞质背景，不利于蛋白免疫荧光分析。说明不同材料在蛋白免疫分析中，处理的方式不尽相同。同时，我们看到根尖材料在酶解后再进行染色体制备，对于间期细胞的形态具有较好的保护作用。本实验可以为同时实现染色体蛋白抗体信号的检测和完好的间期细胞形态的观察提供依据，并且本研究中所建立的检测方法操作简单，重复性高，有利于水稻蛋白免疫检测中，蛋白抗体的鉴定与分析。

3材料与方法
3.1供试材料
2012年在扬州大学试验田种植的水稻品种中籼3037的花培单倍体材料T2037。

3.2根尖的收获与保存 
取新长出的2~3 cm长的根尖，置于4%多聚甲醛(W/V)中，在20℃下处理1 h。然后将供试材料切取1 mm左右的根尖分成四组处理，A组用PBS缓冲液保存待用；B组用甲醇保存待用；C组和D组在酶解液(2%纤维素酶与1%果胶酶)酶解30 min后，用蒸馏水洗涤后，再分别用PBS和甲醇保存。

3.3根尖染色体制备及蛋白抗体检测
根尖染色体制备及蛋白抗体检测按Gong等(2009)方法进行：从保存液中取出根尖在载玻片上，用盖玻片压上，轻轻的敲击盖玻片，使根尖充分破碎呈云雾状后倒置玻片于滤纸上，轻压载玻片，压好的载玻片放入液氮中处理2 min左右，取出后立即用刀片揭去盖玻片，自然晾干后，向每张载玻片上滴加20 μL含有anti-CENH3抗体的1×TNB溶液，盖上盖玻片，放入湿盒内于37℃保温4~6 h；玻片放于染缸中，置于水平摇床上用1×PBS洗片3次，每次洗涤5 min。每张玻片加50 μL含有Goat anti rabbit-488 (Invitrogen)的1×TNB溶液，放入湿盒内于37℃避光保温60 min后用1×PBS洗片3次；自然晾干后，加12 μL含有DAPI的抗褪色剂，盖上22 mm×22 mm盖玻片后放于4℃冰箱中，待观察。

3.4杂交后检测与图象处理
Olympus BX60镜检中获得清晰图像后，以气冷式数码相机(CCD) (Olympus, DP80)摄像。

3.5间期细胞及杂交信号数目统计
在荧光显微镜下，每组随机观察100个细胞，统计形态完整的间期细胞数目、可观察到检测信号的间期细胞数以及信号数达到12个的间期细胞数，并且比较CCD成像的照片中细胞质背景情况。

作者贡献
薛超是本研究的实验设计和实验研究的执行人；吕晓强是完成数据分析，论文初稿的写作；张明亮和刘秀秀参与实验设计，试验结果分析；龚志云是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由教育部霍英东教育基金会第十三届高等院校青年教师基金(131030)、国家自然科学基金(30600345)、江苏省高校自然科学研究计划资助项目(10KJB180009)和省研究生科研创新计划(CXLX12_ 0922)共同资助。

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