玉米是一种重要的粮食、饲料、工业原料及生物能源等多元作物。近年来，由于农村劳动力大量进城务工，玉米生产上杂草危害已造成玉米大幅度减产，严重的减产30%以上。育种家因常规育种材料中缺乏抗性种质资源而难以育成抗性品种。为了拓宽育种资源，寻求突破，各国育种学家愈来愈广泛地应用转基因工程等现代生物技术手段于育种研究中，企图打破物种间生殖隔离，从其他物种克隆一些控制优良性状的外源基因导入玉米中，达到培育高产、优质、抗病虫、抗除草剂、抗逆性强的玉米新品种应用于生产，可以降低草害的危害，提高玉米产量，增加农民收入，对农业生产具有重要作用。

目前，国际上，耐除草剂性状始终是转基因作物的主要性状。在2011年，耐除草剂性状被运用在了玉米等粮食作物，大豆、油菜等油料作物以及棉花、甜菜、苜蓿等经济作物中，种植面积达到9390万公顷，占全球转基因作物种植面积的59% (James, 2012, 中国生物工程杂志, 32(1): 1-14)。草甘膦是目前世界上使用最广泛，用量最大的除草剂，具有广谱性、灭生性、内吸性、传导性、易被土壤微生物分解和在土壤中基本无残毒等特性(Baylis, 2000; Christensen et al., 1992)，但直接使用在农田上会造成作物受害，甚至死亡。因为草甘膦能与植物体内芳香族氨基酸的合成途径中的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosate synthase (EPSPS))特异性地结合，并抑制其活性，从而影响生理代谢途径，阻断高等植物体内芳香族氨基酸的合成，最终植株因芳香族氨基酸的缺乏而死亡(Amrhein et al., 1980)。因此，利用转基因等基因工程将来源于微生物等抗草甘膦基因转入玉米材料，最终培育出抗草甘膦玉米新品种应用于生产，就可以在田间直接喷施除草剂草甘膦来控制杂草生长且不伤害玉米植株，从而既解决玉米杂草危害有提高生产效率。有研究表明，EPSPS是草甘膦在植物细胞中唯一的靶标酶，这个酶的表达量水平直接影响植物对草甘膦的耐受性。抗草甘膦育种通常有三条途径：一是导入过量表达的EPSPS基因，使得植物有足够的靶酶以满足代谢的需要；二是导入修饰的或突变的EPSPS基因，使草甘膦丧失对靶酶的竞争性抑制作用(Reinbothe et al., 1991)；三是导入草甘膦降解酶基因，达到获得耐草甘膦转基因作物的目的(Tan et al., 2006)。目前，全世界转基因作物中，使用最多的耐草甘膦基因是美国孟山都公司拥有多项专利的CP4-epsps基因(Heck et al., 2005; Funke et al., 2006)，来源于根癌农杆菌，已成功在玉米、大豆、棉花、烟草等作物上获得抗草甘膦转基因新品种并商业化使用。我国在转基因抗草甘膦作物研究方面，经过前些年的发展，目前已取得一些重要进展，但都还处在转基因安全管理的中间实验、环境释放等阶段，国内尚未有报道具有自主知识产权的抗草甘膦作物成功商业化，唯有转植酸酶基因玉米在小范围内生产试验的报道。G2R79-epsps基因来源于长期受草甘膦污染的土壤中分离的G2菌株(荧光假单胞杆菌)和宏基因组文库中分离的R79菌株，是中国农业科学院生物技术研究所林敏实验室克隆的，并构建在同一载体的双价基因，该基因不含有CP4专利保护的保守序列和突变位点。G2-epsps基因与CP4-epsps基因的序列相似性仅为24.5% (朱玉, 2002)。将G2-epsps基因转入烟草和棉花，获得了可以耐受0.14%草甘膦的转基因烟草和可以耐受0.07%草甘膦的转基因棉花(刘锡娟等, 2007)；将来源于原核生物的G2-epsps基因通过植物密码子优化，改造获得的新基因称为2mG2-epsps。将2mG2-epsps基因转入玉米，获得了耐草甘膦转基因玉米(赫福霞等, 2008; 王秀君等, 2008; 余桂容等, 2010a; 2010b)。

本研究是在前期实验的基础上，将上述两个抗草甘膦epsps基因构建在同一个植物表达载体上，并通过农杆菌介导法直接转化玉米幼胚，以2mG2-epsps基因作为筛选标记基因，直接应用草甘膦筛选获得无选择标记的、具有耐草甘膦性状的转化玉米材料，并对转化植株及后代进行了分子检测和抗性鉴定，筛选到对草甘膦较好抗性的转基因后代材料，为选育抗草甘膦转基因玉米新品种奠定基础材料。

1结果与分析
1.1转基因玉米再生植株的获得
用农杆菌介导转化适龄的玉米幼胚，转化后的幼胚经过共培养，再进行恢复培养。恢复过程中开始形成愈伤组织，再进行梯度筛选培养：在加有不同浓度选择压的草甘膦培养基上逐步培养，筛选过程中愈伤组织会产生不同程度的褐化现象，挑选没有褐化的愈伤经过继续筛选培养获得致密的抗性愈伤组织(图1A)。然后经过胚状体诱导培养和分化培养，陆续分化出簇状绿色小苗(图1B)。小心将小苗分株经过促壮培养和生根培养，约7 d左右就长成5~7条新鲜根，开盖炼苗(图1C)，1~2 d后移栽进温室营养杯营养土中生长，移栽成活率达到95%以上(图1D)。

图1 玉米转化植株的再生过程 Figure 1 The Process of Regeneration of Transgenic Corn Plants

1.2 T₀代转化植株的抗性鉴定
本研究获得了供试的78599、综31共32株再生植株(其中来源于78599的9株, 来源于综31的23株)，叶片涂抹草甘膦表型鉴定表明：非转基因苗从涂抹叶片尖端开始变黄发枯，慢慢整个叶片从顶端到叶鞘从边缘到中心变黄变枯，同时整个植株心叶开始变白，直至整株枯死(图2A)；而真正的转基因苗表现出较好的耐性，几乎与对照没有变化，整个叶片和植株青枝绿叶，表现完全无损(图2B)。抗性株和非抗性株叶片涂抹后10 d左右表型对比明显，左边3片为抗性植株叶片，右边3片为敏感植株叶片(图2C)。

图2 玉米转化植株涂抹鉴定 Figure 2 Glyphosate-resistant plants identification

1.3 T₀代转化植株的PCR鉴定
对获得的32株转基因植株，设计目的基因的特异引物，经多批次重复PCR，检测到7株阳性植株(其中来源于78599的2株, 来源于综31的5株)。PCR结果表明，阳性转基因植株扩增出特异引物设计大小1 237 bp的目标条带(图3)，可以初步证明外源基因G2R79-epsps已经整合到玉米的基因组中。

图3 T0代转基因玉米的PCR检测结果 Figure3 PCR Analysis of T0 Transformed Plants

1.4转基因阳性植株后代材料抗性水平鉴定
对转基因阳性植株T₁鉴定保存下来的材料，T₂代在苗期进行穗行喷施草甘膦不同浓度2‰、4‰、6‰、8‰、16‰，鉴定其耐性水平。结果分离出抗性差异非常大的穗行和植株，有的穗行和植株完全不抗，即使使用最低生产使用浓度2‰的草甘膦处理，也会完全枯死；有的穗行和植株能耐草甘膦生产使用浓度的3倍(即6‰, 图4A)，但如果用8‰和16‰的草甘膦处理，则发生心叶发白，有的枯死，有的畸形，最终不能抽穗结实(图4B)。

图4 T2转基因材料草甘膦抗性水平鉴定 Figure 4 Identification of glyphosate tolerance of T2 transgenic maize

玉米生产上草甘膦的田间使用浓度是2‰的，本研究结果表明：双价基因G2GR79-epsps转化玉米阳性植株的抗性达到6‰，即生产使用浓度的3倍，一切生长表现正常。当使用浓度超过6‰时，转化后代有一定耐性，但生长明显受抑制，心叶发白，不能正常结实；当使用浓度达到16‰时，植株不能正常生长。

2讨论
受到21世纪人口膨胀压力等因素的驱动，生物技术特别是转基因作物将成为解决21世纪食物保证的重要措施之一，这一点已越来越成为共识。近年来，国际国内关于作物转基因研究和商业化种植都呈迅猛势头发展，除草剂性状任然是转基因最主要的性状，占整个转基因作物种植面积的59%。抗多种除草剂及抗虫等复合两种或三种性状的转基因也越来越成为的一个重要的特色，是近两年来增长最快的一类性状。

本研究采用来源于不同菌株的抗除草剂草甘膦基因复合组装在一起，以期提高抗性水平，结果获得了具有生产实用价值的抗性转基因玉米材料。又因为高等植物体内整个芳香族氨基酸的合成过程是在叶绿体中进行(Della-Cioppa et al., 1986)的，所以我们在构建抗性基因G2GR79-epsps构建高效表达载体时，在基因上游连接了一段来自拟南芥叶绿体导肽CTP编码区序列，让抗性主要集中在叶片等绿色器官中表达，田间除草剂使用也主要喷施在叶片上，从而能够大大提高转基因植株的抗性。在目的基因上游还加载了玉米泛素蛋白启动子(Ubiqintin-P)，能更好地特异地启动外源基因在玉米基因组上表达。

通常田间除草所使用的草甘膦浓度为2‰。本实验通过筛选得到的抗草甘膦玉米植株在不同世代均出现性状分离，T₀代由于植株来之不易，只用了较低的草甘膦选择压(1-2‰)进行涂抹鉴定和筛选，结果T₀代植株有的抗，有的不抗，这是因为愈伤组织在筛选过程中因筛选压等原因出现的假阳性；T₁代植株和T₂代植株使用不同浓度梯度实验表明穗行间和单株间表现出抗性差异，有的穗行能抗2‰，有的穗行能抗4‰，有的穗行能抗6‰，有的穗行完全不抗，在抗性穗行中也有不同比例的单株表现出不抗，而抗性强的植株其他生长性状并未受到影响，说明组建的嵌合双价抗草甘膦epsps基因进行了充分的表达，有的可能表达量高一些，有的表达量低一些。我们获得的耐草甘膦植株T₂代的转基因植株对草甘膦的抗性最高可达到6‰，这是草甘膦生产上使用浓度的3倍，因而获得了具有重要使用价值的基础材料。我们后续工作将从后代分离群体中鉴定和筛选出抗性表达水平高的单株，经多代筛选自交纯化，最终获得遗传稳定的纯系，进一步综合其他优良农艺性状用于新品种配制和选育。关于获得的转基因植株中抗草甘膦epsps基因在玉米染色体上的整合情况，拷贝数以及能否稳定地遗传给后代、遗传规律等问题，有待进一步的研究和分析。

3材料与方法
3.1试验材料
转化试验于2010年、2011年和2012年分别在中国农业科学院作物科学研究所和四川省农业科学院生物技术核技术研究所进行，转化后代材料2012年在四川成都完成田间鉴定，所用玉米自交系78599(四川省农科院生核所保存)、综31(中国农业科学院作物研究所保存)。

3.2菌株和质粒
双价基因G2GR79-epsps (中国农科院生物技术研究所林敏研究员惠赠)，所用植物表达载体质粒为pCMG2R79-epsps，长度为13 312 bp，G2-epsps基因序列位于来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(PCaMV)和3′尾部(TCaMV)之间，GR79-EPSPS基因序列位于玉米泛素蛋白启动子(Ubiqintin-P)和尾部(nos-polyA)之间，两个基因序列前端均加入一段叶绿体前导肽基因序列(At-CTP)，以增强双价基因在受体植物叶绿体中的表达(图5)。

图5 pCMG2R79-EPSPS植物表达载体构建图 Figure 5 Construction of pCAMBIA 2301-35S::2mG2 R79-EPSPS plant expression vector

农杆菌菌株：EHA105 (中国农科院生物技术研究所保存)。

3.3玉米转化用培养基及溶液
基本培养基：4 g/L NB*(N6大量元素+B5微量元素)+1 mol/L N6有机*+0.7 g/L脯氨酸(Pro)+0.5 g/L水解酪蛋白(AHC)+20 g/L蔗糖(Suc)+3.0 g/L植物凝胶*。

侵染培养液(info)：2.15 g/L MS盐*(MS大量元素+MS微量元素)+1 mol/L MS有机*+0.1 g/L肌醇+68.5 g/L Suc+36 g/L葡萄糖(Glu)+2 mg/L 2,4-D+100 μmol/L乙酰丁香酮(AS)，pH 5.2。

共培养培养基：2.15 g/L MS盐*+1 mol/L MS有机*+20 g/L Suc+10 g/L Glu+0.7 g/L Pro+0.5 g/L AHC+2 mg/L 2,4-D+100 μmol/L AS+10 mg/L AgNO₃+100 mg/L半胱氨酸(Cys)+3.0 g/L植物凝胶*，pH 5.4。

恢复培养基：基本培养基+2 mg/L 2,4-D+10 mg/L AgNO₃+0.5 g/L乙磺酸(MES)+250 mg/L头孢霉素(Cef)，pH 5.8。

筛选培养基1：恢复培养基-10 mg/L AgNO₃+0.6 mmol/L草甘膦，pH 5.8。

筛选培养基2：恢复培养基+0.8 mmol/L草甘膦，pH 5.8。

筛选培养基3：恢复培养基-10 mg/L AgNO₃+1.0 mmol/L草甘膦，pH 5.8。

诱导胚状体培养基：基本培养基+30 g/L Suc+5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D+250 mg/L Cef，pH 5.8。

分化培养基：诱导培养基(去6-AB和2,4-D)，pH 5.8。

生根培养基：2.15 g/L MS盐*+1 mol/L MS有机*+30 g/L Suc+0.2 mg/L NAA+0.01 mmol/L草甘膦+2.5 g/L植物凝胶*，PH 5.8 (*为世界著名的植物培养基供应商PhytoTechnology Laboratories™公司进口，由北京西美杰科技有限公司代理)。

3.4农杆菌介导法转化玉米幼胚
3.4.1基因工程菌农杆菌的培养
挑取EHA105基因工程菌种划线培养，挑单菌落接种于5 mL YEP培养液中，28℃、200 rpm振荡培养过夜，生长至对数生长期，然后按1:50的接种量转接于YEB液体培养基中，继续震荡培养，至0D600值为0.6左右。离心后用浸染液重新悬浮菌体，调菌液浓度为OD600为0.2~0.4，并加入AS (100 μmol/L)备用。

3.4.2外植体的侵染、筛选和转化植株的再生
挑选0.8~1.5 mm大小幼胚放入装有info的小管中，45℃条件下热激0~5 min，立即吸干info，加侵染液5 min，转入含100 mg/L L-cys的共培养基上，晾干液体，盾片朝上均匀摆放；在23℃共培养3 d；转到恢复培养基上，25℃~28℃恢复培养4~10 d，转入筛选培养基，筛选2~4次，2周/次；设置共培养后的幼胚部分直接进入筛选培养基做对照；挑选抗性愈伤组织放在诱导胚状体的培养基上，培养2周左右；将胚状体转移至分化培养基上；将分化出的簇状小苗从愈伤块上单株切下，放入1/2MS生根培养基，5~7 d根系长好，练苗1 d，植入小型塑料营养杯。

3.5转化苗的表型鉴定和分子检测
3.5.1转化再生植株的田间表型鉴定和管理
对所有转化再生植株用2‰草甘膦涂抹叶片，进行表型鉴定。用毛笔沾取草甘磷涂抹5叶1心大小的植株顶端倒二叶1/2叶，7 d后观察植株受害情况。耐性好的移栽至大盆，精心管理，及时授粉，尽量套袋自交，保证结实。对有些自交不协调的T₀代转化株，采用受体亲本回交结实。T₁代苗期喷施2‰草甘膦鉴定抗性，自交保种。T₂代在苗期进行穗行喷施草甘膦不同浓度2‰、4‰、6‰、8‰、16‰鉴定其抗性。

3.5.2表型抗性好的转化植株DNA的提取及PCR检测
改良CTAB微量提取法提取基因组DNA。特异PCR引物序列：pCMG2R79 primer F：5'-GCACTCTCAGCAGCCAGAAGA-3'和R：5'-GACGCCAGAGCCTTCCAGTA-3'，扩增片段长度1 237 bp。

作者贡献
余桂容、杜文平、宋军、刘艳和陆伟是本研究的实验设计和实验研究的执行人；余桂容完成数据分析，论文初稿的写作；杜文平和刘艳参与实验设计，试验结果分析；徐利远和王国英是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢：
本研究受到转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08003-003B)、四川省农科院财政基因工程项目(2011JYGC01-002)、农业部“西部之光”人才培养计划(2010-2011)和四川省农科院高新技术研究应用专项(2013-2014)共同资助。本研究过程中受到中国农科院作物研究所刘允军老师的悉心指导，中国农科院生物研究所林敏研究员提供双价基因，作者在此一并呈谢。

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