磷是植物的核酸、核蛋白、磷脂、三磷酸腺苷等的主要组成成分(Abel et al., 2002; Hammond et al., 2004; Panigrahy et al., 2009)，也是植物生长过程中所必须的大量营养元素之一(Bieleski, 1973; Ragh- othama, 1999)，在植物体的新陈代谢中发挥了重要的作用。虽然土壤中的有机磷可高达80%，却不能被植物吸收，有机磷必须转化为无机磷后才能被吸收利用(Schachtman et al., 1998; Holford, 1997; Richardson, 1994)。在农业生产上，常用追加磷肥的方法以确保作物的正常生长和发育，而全球的易开采磷矿石资源在本世纪却面临消失殆尽的危机(Gilbert, 2009; Vance et al., 2003)。

植物在长期的进化过程中，已形成一系列包括形态和生理方面的改变以提高低磷供给条件下的多种增强吸收和利用的途径，如增加根冠比(Lynch, 1995; Williamson et al., 2001)、酸性磷酸酶活性(Duff et al., 1994; del Pozo et al., 1999)以及增加有机酸的合成与分泌等(Jones, 1998)。其中，紫色酸性磷酸酶属于含有异价双核金属的金属磷酸酯酶家族，催化磷酸酯或酸酐的水解成无机磷酸根，部分家族成员还具有植酸酶活性能把植酸分解为无机磷(Hegeman and Grabau, 2001; Kuang et al., 2009; Zhang et al., 2008)。在植物中，随着基因组序列库的不断丰富，已有一系列的PAP被分离和鉴定。Li等(2002)从拟南芥中预测了29个PAP，并对其中7个拟南芥PAP(AtPAP7-AtPAP13)在低磷胁迫下的表达特征做了研究，其中AtPAP11和AtPAP12被诱导上调表达。Zhang等(2011)通过生物信息学预测得到26个PAP，表达分析发现10个PAP显著受到缺磷诱导表达，其表达可能直接受到转录因子OsPHR2的调控。Li等(2012)从大豆中鉴定了35个酸性磷酸酶基因，有29个基因受到诱导或增强表达，其中部分酸性磷酸酶基因在根瘤中受到低磷胁迫诱导表达。LePS2是从番茄体内分离出的酸性磷酸酶基因。在磷缺乏条件下，番茄体内的LePS2能够快速地被诱导表达，而在供磷恢复时其表达又被抑制(Baldwin et al., 2001)。卢坤等(2010)从甘蓝和白菜中分别克隆到BoPAP17和BrPAP17，并对两个基因在不同处理时间的组织表达情况进行研究，结果表明PAP17在白菜和甘蓝根部可能参与了根外磷的活化与吸收及无机磷由根部向其他组织器官的转运。

玉米已是中国第一大粮食作物，在生产上面临着土壤有效磷供给不足和利用率较低的双重制约。因此，鉴定低磷胁迫应答相关基因并研究玉米耐低磷分子机制，对培育耐低磷玉米品种具有重要的理论和实践意义。本研究前期利用磷高效玉米自交系178构建的抑制差减文库(SSH)中筛选出一个显著上调表达的EST(expression sequence tag)，通过对其序列分析发现，该EST对应的基因编码酸性磷酸酶(Huang et al., 2010)。因此，我们拟进一步从该材料中分离出该EST对应基因的全长cDNA序列，并以实时荧光定量PCR分析该基因在低磷胁迫下的时空表达特征。同时，分析该基因在14个玉米自交系中的序列变异，为进一步探索酸性磷酸酶基因的种质多样性及耐低磷玉米新品种培育提供参考信息。

1结果与分析
1.1 ZmPAP18克隆及序列特征分析
运用RT-PCR方法，以玉米自交系178的cDNA为模板扩增获得一条长约1.4 kb的片段(图1)，经回收测序后发现，该基因CDS区域长1 371 bp，编码457个氨基酸，等电点为5.95，不稳定系数为40.85，总平均亲水性为0.440，TMHMM分析得出其跨膜结构有1个，跨膜区由25个氨基酸组成。经保守结构域分析发现，在该基因的氨基酸序列中存在紫色酸性磷酸酶(PAP)特有保守结构(GDLG-GDLSY-GNHE- VLLH-GHVH, 粗体代表保守的氨基酸残基) (图2)。

图1 玉米自交系178的ZmPAP18全长克隆 注: M: DL2000 DNA marker; 1: ZmPAP18基因PCR产物 Figure 1 Cloning of ZmPAP18 from maize inbred line 178 Note: M: DL2000 DNA marker; 1: PCR product of ZmPAP18

图2 ZmPAP18的cDNA序列和编码氨基酸序列 注: 矩形所示为5个保守基序, 7个保守的氨基酸残基用黑色背景标记 Figure 2 The cDNA sequence and the deduced amino acids of ZmPAP18 Note: Five conserved motifs were marked with empty black rectangles and seven metal-ligating amino acid residues were marked with black background

1.2 ZmPAP18系统进化分析
将玉米PAP与水稻、拟南芥等植物的PAP进行同源比对，利用MEGA 5.0以NJ法构建了系统进化树(图3)。从图中可以看出，所有PAP蛋白共分为3个基因家族(Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ)，进一步可以归为8个亚家族(Ⅰa-1, Ⅰa-2, Ⅰb-1, Ⅰb-2, Ⅱa, Ⅱb, Ⅲa和Ⅲb)，这与前人各自对拟南芥和水稻的研究结果一致。并且本研究获得的玉米PAP编码蛋白在亲缘关系上与OsPAP18和AtPAP18最为接近，故将该基因命暂名为：ZmPAP18。

图3 ZmPAP18与拟南芥、水稻等植物PAP之间的系统进化关系 注: 拟南芥: Atpap1-Atpap29 (NP_172830.1, NP_172843.1, NP_172923.3, AAW29946.1, NP_564619.1, NP_176033.1, NP_178297.2, NP_178298.2, NP_178444.1, NP_179235.1, NP_179405.1, NP_180287.2, NP_973585.1, NP_973704.1, NP_187369.1, NP_187626.1, NP_566587.1, NP_188686.2, NP_190198.1, NP_190846.1, NP_190849.1, NP_190850.2, NP_193106.3, NP_194219.2, NP_195353.1, NP_198334.1, NP_199851.2, NP_200524.1, NP_201119.1); 水稻: Ospap1a-Ospap1d (NP_001049368, ABA99053, NP_001067110, NP_001067109); Ospap3a-Ospap3c (ABA94167, NP_001064054, NP_001049500); Ospap7 (ABA94168), Ospap9a-Ospap9b (NP_ 001058738, NP_001044534); Ospap10a-Ospap10d (NP_001044416, EEE53671, NP_001067369, ABA99980); Ospap15 (ABF99890); Ospap18 (NP_001050513); Ospap20a-Ospap20b (AAX94838, NP_001066169); Ospap21a-Ospap21c (NP_001052730, AAX94837, NP_001066168); Ospap23 (NP_001061440); Ospap26 (NP_001058182); Ospap27a-Ospap27c (NP_001063606, NP_001062330, EA-Z09673); 大豆: Gmpap3 (NP_001236677.1); 甘薯: Ibpap1 (CAA07280.1); Ibpap2 (CAA06921.1) Figure 3 Phylogenetic relationship analysis of ZmPAP18 based on amino acid sequence Note: Arabidopsis thaliana: Atpap1-Atpap29 (NP_172830.1, NP_172843.1, NP_172923.3, AAW29946.1, NP_564619.1, NP_1760- 33.1, NP_178297.2, NP_178298.2, NP_178444.1, NP_179235.1, NP_179405.1, NP_180287.2, NP_973585.1, NP_973704.1, NP_187- 369.1, NP_187626.1, NP_566587.1, NP_188686.2, NP_190198.1, NP_190846.1, NP_190849.1, NP_190850.2, NP_193106.3, NP_194219.2, NP_195353.1, NP_198334.1, NP_199851.2, NP_200524.1, NP_201119.1); Oryza sativa: Ospap1a-Ospap1d (NP_001049- 368, ABA99053, NP_001067110, NP_001067109); Ospap3a-Ospap3c (ABA94167, NP_001064054, NP_001049500); Ospap7(ABA-94168); Ospap9a-Ospap9b (NP_001058738, NP_001044534); Ospap10a-Ospap10d (NP_001044416, EEE53671, NP_001067369, ABA99980); Ospap15 (ABF99890); Ospap18 (NP_001050513); Ospap20a-Ospap20b (AAX94838, NP_001066169); Ospap21a-Ospa- p21c (NP_001052730, AAX94837, NP_001066168); Ospap23 (NP_001061440); Ospap26 (NP_001058182); Ospap27a-Ospap27c (NP_001063606, NP_001062330, EAZ09673); Glycine max: Gmpap3 (NP_001236677.1); Ipomoea batatas: Ibpap1 (CAA07280.1); Ibpap2 (CAA06921.1)

1.3低磷胁迫下ZmPAP18的表达特征分析
分别提取不同时间段低磷胁迫处理后178叶片和根的总RNA，以反转录后的cDNA为模板，通过实时荧光定量PCR分析其时空表达模式。结果表明，ZmPAP18在根(Root)和叶(Leaf)中均受到低磷胁迫的诱导增强表达，且在24 h表达量达到最高。从低磷胁迫诱导的时间看，在处理6 h后，ZmPAP18在178的叶片和根系中表达量都相对最低，在胁迫处理至12 h，根系中的ZmPAP18开始上调表达，而在叶片中，胁迫处理24 h后ZmPAP18才开始上调表达，说明根系中ZmPAP18响应低磷胁迫更为迅速。同时，比较根和叶的应答差异发现，胁迫早期时该基因在根中受低磷诱导更为强烈(图4)。

图4 ZmPAP18在玉米自交系178的叶片和根中的表达模式 Figure 4 Gene expression profiles of ZmPAP18 in leaves and roots of maize inbred line 178

1.4 ZmPAP18基因结构及序列变异分析
通过与玉米B73全基因组测序结果和NCBI中的非冗余序列比对后，分析ZmPAP18对应的B73基因结构(图5)发现，该基因由5个外显子组成，分别标为Ex1至Ex5，包括1 371 bp的编码序列、151 bp的5'非翻译区(UTR)和330 bp的3'UTR；外显子中间有4个内含子，此外还包括启动子及其调控元件序列等。

图5 玉米ZmPAP18的基因结构和序列变异分析 注: 外显子和内含子位置与长度与图中标示的位置和长度相对, 应外显子用灰色矩形框表示, 引物PP_1所扩增的序列变异区域用黑色矩形框表示 Figure 5 Gene structure and sequence variation analysis of ZmPAP18 Note: The length of exons and introns are corresponding to the scale below the structure, exons, denoted as gray rectangles, are separated by introns denoted as lines, the sequence variation region, denoted as dark black rectangle, was amplified by primer PP_1

为初步探索该基因在常用玉米自交系种质中的序列变异，对该基因设计一系列引物在178和9782中进行PCR扩增及电泳检测。其中一对引物(PP_1-F: 5'-CCGTCGTATGTCACTTTGCT-3', PP_1-R: 5'-CCTGATGTCTCCTTGATGCT-3')所扩增的目的片段，长度约200 bp，位于该基因的第五个外显子(5 426~5 638 bp)。继续用该引物扩大到14个国内常用玉米自交系中对该区域进行分析表明 目标区段存在丰富的长度多态性(图6)。对目的片段测序发现其主要变异为一个位于3'非翻译区的Indel (GTTGT)，这一变异位点是否与耐低磷特性有关值得进一步验证(图5)。

图6 ZmPAP18在14个玉米自交系的长度多态性 Figure 6 Length polymorphism of ZmPAP18 among 14 maize inbred lines

2讨论
紫色酸性磷酸酶纯化蛋白的粉红或紫色部分是由于在发色基团铁离子和酪氨酸之间的电子转移导致的，而非发色基团则是动物PAP或植物酶的锌或锰离子部分(Olczak et al., 2003)。该酶不仅在体内发挥作用，还出现在根系分泌物中，可增加对细胞外有机磷的分解利用(Tran et al., 2010)。这类酶在其羧基端有一个保守结构域，由5个保守基序构成，其中含有7个保守氨基酸残基(DXG-GDXXY-GNH(D/E)- VXXH-GHXH, 粗体代表保守的氨基酸残基) (Li et al., 2002)。在本研究克隆的ZmPAP18中也发现了这段特征性序列，间接证明ZmPAP18具备酸性磷酸酶特征，而且系统进化树分析表明在亲缘关系上与水稻OsPAP18和拟南芥AtPAP18最为接近，因此将该基因命名为ZmPAP18，同时这一结果也将为研究进化过程中近缘物种间基因家族水平的基因结构和基因功能之间的关系提供了重要线索。

紫色酸性磷酸酶是植物体对低磷应答反应及其信号转导途径的重要调控因子，已有研究发现拟南芥中只有AtPAP11和AtPAP12受低磷诱导表达(Li et al., 2002)，水稻中有10个PAP基因(OsPAP1a, Os- PAP1d, OsPAP3b, OsPAP9b, OsPAP10a, OsPAP10c, OsPAP20b, OsPAP21b, OsPAP23和OsPAP27a)受缺磷诱导表达(Zhang et al., 2011)，未发现PAP18受缺磷诱导表达的报道。然而，本研究对ZmPAP18表达模式分析表明，该基因在178幼苗的根和叶中均受磷饥饿诱导，表达量随着胁迫时间延长而升高，到24 h时表达量达到峰值，且根系比叶片对低磷的反应更快速灵敏；同时，根部的ZmPAP18基因磷饥饿诱导表达更为强烈。据此我们推测，酸性磷酸酶基因的表达模式在植物中存在不同差异，玉米ZmPAP18基因在根部可能参与了植物根外磷的活化与吸收及无机磷由根部向其他组织器官(如: 叶片)的转运，对提高玉米的磷利用效率和对低磷环境的适应能力具有重要的意义。 

玉米基因组的序列变异极为丰富，Ching等(2002)对玉米DNA多态性分布的频率进行研究，发现SNP在非编码区的频率为31 bp，而编码区频率为124 bp，Indel在非编码区域频率比编码区较高(频率为85 bp)。在本研究对ZmPAP18的基因结构及序列变异分析发现，该基因在选用的14个自交系中存在一个5 bp的Indel位点，位于第5个外显子的3'非翻译区，同时存在于耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782中。很多酶活性的改变都因基因部分变异引起(Leelapon et al., 2004)，这一序列变异能否影响紫色酸性磷酸酶的活性，从而导致自交系间磷素利用能力的差异，值得进一步的研究与验证。

3材料与方法
3.1实验材料和处理
 本研究总共选取14个国内常用玉米杂种优势群代表性材料和热带种质材料用于试验(表1)。其中，自交系178 (耐低磷)和9782 (低磷敏感)是本研究前期鉴定为对低磷反映具有极端敏感差异的材料；178用于基因克隆和表达分析，连同其余13个材料一并用于基因序列多态性分析。

表1 14个玉米自交系系谱 Table 1 Pedigree (source) of the 14 maize inbred lines

将玉米自交系178种子埋入石英砂中，37℃催芽，20℃~28℃光照培养。至3叶1心时，选取一部分长势整齐的178幼苗移入Hoagland营养液中适应性培养2 d后，将幼苗移至两种供磷水平的营养液中，分别为低磷(1 μmol/L)和对照(1 mmol/L)，营养液配制参考Hoagland营养液配方。分别取178低磷处理后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h及对照的根系和叶片，用于总RNA提取；其余材料取幼嫩叶片，用于总DNA提取。

3.2核酸的提取
材料采集后立即置入液氮速冻，-80℃冰箱保存备用。玉米自交系基因组总DNA的提取采用CTAB法进行(Porebski et al., 1997)。总RNA提取的具体操作步骤参照Invitrogen公司的Trizol试剂盒说明书。样品的纯度用核酸蛋白仪(SMARTSPECTM300型, Bio-Rad公司)测定，RNA的完整性用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

3.3 ZmPAP18克隆及序列分析
根据从MaizeSequence中(http://www.maizesequence.org/index.html/)提取的玉米模式自交系B73的PAP序列(GRMZM2G174549_T01)，用Primer 5.0设计特异性引物：ZmPAP1-F (5'-TGCCATGGCTCCG- CTCCC-3')，ZmPAP1-R (5'-ACATCGCAGGCCCAAGCT-3')，扩增片段长1 409 bp。将178的总RNA用TaKaRa公司的反转录试剂盒(Code: DRR037A)合成cDNA第一链，并以此为模板进行PCR扩增，扩增程序为95℃预变性3 min；95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min，获得Zm- PAP18全长(包含完整CDS区)。PCR产物经凝胶回收后连接至pMD19-T载体(TaKaRa, 大连)，送Invitrogen测序。

从NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载水稻和拟南芥等植物已知的PAP蛋白序列，应用ME- GA 5.0 (Tamura et al., 2007)软件邻接法(Neighbor-Joining method)的Pairwise Deletion模式，进行Boots- traping检验，重复1 000次，Random seed，构建系统进化树，分析ZmPAP18与其他PAP的亲缘关系。

3.4 ZmPAP18表达分析
将不同胁迫处理总RNA反转录合成的cDNA作为qRT-PCR模板，根据测序结果，用Primer 5.0设计荧光定量PCR引物：ZmPAP2-F (5'-TGTCATTGGCTGTTGTTGGT-3')，ZmPAP2-R (5'-AGGAATCC- CACAAGTGTTGC-3')，扩增片段长144 bp；内参基因为18S和GAPDH，引物为：18S-F (5'-CTGAGAAACGGCTACCACA-3')，18S-R (5'-CCCAAGGTCCAACTACGAG-3')和GAPDH-F (5'-ACTTCGGCATTGTTGAGG-3')，GAPDH-R (5'-AAGTCGGTAGAAACCAGAT-3')。采用SYBR Green (TaKaRa, DRR081A)和iQTM 5 thermal cycler (Bio-Rad USA)荧光定量PCR仪进行实时荧光检测。本研究采用iQTM 5 Optical system software (v2.1)软件对目的基因的表达水平进行相对定量，每个处理的时间段和对照时间段的样品均设3次技术重复和3次生物学重复(Bustin et al., 2009)。

3.5 ZmPAP18基因结构及序列变异分析
应用DNAstar等软件对ZmPAP18结构进行分析，并在其外显子和内含子区域设计一系列PCR引物，通过琼脂糖和聚丙烯凝胶电泳，筛选出在178 (磷高效)和9782 (低磷敏感)之间有长度差异的引物，并在14个玉米自交系中进行PCR扩增、电泳、回收测序，重复3次后分析序列多态性。

作者贡献
苏顺宗和刘丹是本研究的实验设计和实验研究的执行人；吴玲及刘丹完成数据分析，论文初稿的写作；聂治、易双及张啸参与实验设计，试验结果分析；高世斌是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家973计划(2009CB118400)、国家948计划(2011-G15-2)和国家自然科学基金(31171566)共同资助。

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