韭菜(Allium tuberosum Rottler)属百合科葱属，原产于中国，由于其具有特殊的风味、营养价值及保健功能，深受人们喜爱。韭菜在生产中大多采用无性繁殖的方式进行多年生生产，在育种中不像其他的蔬菜方便进行杂交育种。另外由于韭菜的自然群体内缺乏有效的抗病、虫、草等优良的基因性状，因此采用现代分子育种方法进行新品种的选育非常必要。目前许多葱蒜类蔬菜已经通过农杆菌介导法建立了高效的再生体系和成熟的转化系统(Eady et al., 1996; Zheng et al., 2001; 张松等, 2003a)。农杆菌介导法具有简便、单拷贝等优点，广泛应用于各种植物的遗传转化中(姚冉等, 2011)，但在农杆菌介导的遗传转化过程中，需要使用抑菌性和选择性抗生素，抑菌性抗生素在外植体与农杆菌共培养后起到抑制农杆菌进一步生长的作用(伊风艳等, 2012)，常用的抑菌抗生素包括头孢霉素(Cefotaxime, Cef)、氨苄青霉素(Ampieillin, Amp)和特美汀(Timentin)等(张福丽等, 2011)。而选择性抗生素根据采用的转化载体应用不同的抗性标记基因筛选转化体，以进行转基因植株的选择。常采用的选择剂有除草剂(PPT)、卡那霉素(Kanamycin, Kan)和潮霉素B (hygromycin B, Hyg)等选择抗生素(欧阳乐军等, 2012)。大多数研究表明植物对不同抗生素的敏感性不同，因此植株对抗生素敏感性的确定是农杆菌介导转化建立的必经过程。在韭菜中，张松等(2003a)对抑菌剂羧苄青霉素(Crb)、Cef和Timentin进行了研究，发现Timentin的抑菌效果好，同时研究了选择剂卡那霉素和G418对韭菜根尖再生的影响。本研究在韭菜的遗传转化中拟使用质粒pCAMBIA1301和pCAMBIA3301进行转化，不同载体和不同外植体对抗生素的敏感性有相当大的差异。因此需要研究潮霉素和PPT对韭菜根尖及愈伤组织的生长和分化的影响，以确定最佳的选择浓度，另外还进行了Timentin和头孢霉素的影响作用研究，以确定韭菜遗传转化中这些抗生素的适宜使用浓度，为韭菜遗传转化体系的建立和优化提供参考。

1结果与分析
1.1韭菜愈伤组织对PPT敏感性的筛选
图1显示不同浓度PPT下韭菜愈伤组织诱导不定芽的生长情况，当PPT浓度为0 mg/L时，愈伤组织生长旺盛，体积迅速膨大，且不定芽分化正常，长势良好；随着PPT浓度增加愈伤组织的生长量逐渐降低，不定芽分化数目也明显减少；当PPT的浓度为0.4 mg/L时，愈伤组织开始出现褐变死亡现象，不定芽分化数仅有2~3个，且不定芽细弱、生长缓慢、开始出现白化现象；当PPT浓度为1 mg/L时，愈伤组织褐化达80%以上，仅有极少数分化出个别零星的细弱白化芽；当PPT浓度为1.5 mg/L和2 mg/L时，愈伤组织褐化均达到95%以上几乎无法生长和分化，最终全部褐变枯死。统计分析表明(表1)，正常情况下不定芽的分化率达到96.93%；在PPT的作用下，随着浓度的增加不定芽的分化率降低，各个处理间的差异显著；当PPT的浓度为1 mg/L时，不定芽的分化率仅为6.20%；浓度继续增大时，不定芽分化率虽然降低但没有极显著差异。为避免转基因植株也被杀死，应选择具有杀灭效果但并未完全杀死的组合。因此，将1 mg/L PPT作为愈伤组织诱导不定芽的筛选浓度。

图1 不同PTT浓度下愈伤组织分化情况 Figure 1 The growth of callus under different PTT concentrations

表1 PPT对韭菜不定芽分化及生根的影响 Table 1 Effect of PPT on the differentiation of adventitious buds and roots of chinese chive

PPT对韭菜不定芽生根影响。当PPT为0时，植株根系发育良好，生根率达到90%，且植株粗壮，叶色鲜绿(图2)；当PPT为0.2 mg/L时，植株生根率为56.60% (表1)，生根速度减慢，根数减少，植株叶片细弱但鲜绿；当PPT为0.4 mg/L时，生根率为16%，植株细弱，不定芽出现白化现象；浓度为0.6 mg/L时，生根率仅有2.3%，植株上部的生长基本停止，大多数叶片白化，其他叶片呈现不正常的翠绿色；当PPT达到0.8 mg/L、1 mg/L时，植株不能生根，整体白化，随后株植死亡。因此，0.6 mg/L PPT作为韭菜生根阶段的筛选浓度。

图2 不同PPT浓度下不定芽生根时不定芽的生长情况 Figure 2 Growth of adventitious buds during rooting under different PPT concentrations

1.2韭菜根尖对潮霉素敏感性的筛选
本研究进行了潮霉素合适浓度的筛选，各浓度附加后的愈伤组织诱导情况如表2所示，浓度为1 mg/L时明显抑制韭菜外植体的分化，其不定芽的诱导率为8%，当浓度达到2 mg/L，抑制作用更加明显，无任何形态组织分化，因此以1 mg/L可以作为转化体的筛选浓度。

表2 潮霉素对愈伤组织诱导的影响 Table 2 The effect of hygromycin on callus induction

1.3抑菌剂头孢霉素浓度的筛选
头孢霉素对愈伤组织生长及分化影响显著(表3; 图3)。当Cef浓度低于200 mg/L时，愈伤组织分化正常，分化率达到95%以上，没有出现褐化现象。当Cef为300 mg/L时，愈伤组织不定芽的分化率降低，开始出现褐化现象。之后随着浓度的增加，韭菜不定芽的分化数越来越少，褐化越来越严重。当浓度为400 mg/L时，不定芽的分化受到抑制，不定芽分化率为66.03%，愈伤的褐化率不到10%。当Cef的浓度过大时，不定芽分化率很低，愈伤褐化率却很高。因此，400 mg/L Cef可以作为韭菜选择培养过程时最佳抑菌浓度。

表3 头孢霉素对韭菜不定芽分化的影响 Table 3 Effect of cefotaxime on the differentiation of adventitious buds of chinese chive

图3 不同Cef浓度下愈伤组织及不定芽分化情况 Figure 3 Callus and adventitious bud differentiation under different Cef concentrations

头孢霉素对不定芽生根的影响(表3)。当Cef浓度为200 mg/L，不定芽生根率达到86.77%，与对照及100 mg/L Cef相比，生根率虽然显著降低，但是降低的幅度仅在10%以内；当Cef浓度为300 mg/L时，生根率降低至40%；浓度进一步增大，生根率逐渐降低，直至无法生根。因此，在不定芽生根阶段，Cef的最佳抑菌浓度为200 mg/L。

1.4抑菌剂Timentin浓度的筛选
以Timentin作为韭菜的抑菌性抗生素，适宜浓度的筛选结果(表4)表明，当Timentin的浓度在400 mg/L以内时，韭菜根尖分化愈伤组织的能力没有受到影响，愈伤分化率为52%~56%；当浓度增加到600 mg/L时，愈伤组织分化受到抑制，分化率降低到36%；当浓度继续升为800 mg/L时，抑制作用明显增加，愈伤分化率仅有3%。因此，以400 mg/L Timentin为农杆菌介导韭菜转化中抑菌的最佳浓度。

表4 Timentin对愈伤组织诱导的影响 Table 4 The effect of Timentin on callus induction

2讨论
2.1选择抗生素在韭菜转化中的作用
转基因植株的筛选是植株遗传转化的重要环节，在植物转化中常以抗生素筛选转化材料，但在试验中常出现筛选结果不准确的现象，确定适宜的筛选压是提高基因转化率的前提。目前，应用除草剂作为选择标记，产生的假转化体少，并为作物产生有用的农艺性状。郭丽等(2009)研究发现，5 mg/L PPT可以作为小麦愈伤组织筛选和不定芽分化阶段的浓度，以2.5 mg/L PPT作为苗生根的筛选浓度。王自章等(2002)在甘蔗的研究表明，也将PPT的浓度分为两个阶段考虑，当愈伤组织分化及小苗生长时浓度为0.75 mg/L；而小苗生根时浓度为0.5 mg/L。另外有些研究也认为PPT的浓度一直保持不变，Eday等(2005)以5 mg/L PPT作为洋葱转基因植株的筛选剂，而臧宁等(2007)在甘薯转化中所用的PPT浓度则为0.3 mg/L。我们的研究表明，在韭菜的转化中，PPT的浓素分为两个阶段考虑，以1 mg/L PPT作为愈伤诱导不定芽的筛选浓度，以0.6 mg/L PPT作为韭菜生根的筛选浓度。从以上的分析看出，对于不同植物PPT的最佳浓度差异比较大，其中的原因有待进一步研究。

潮霉素也是植物遗传转化中最常用的筛选剂，Kondo等(2000)在大蒜茎尖分生组织的转化中，潮霉素浓度从10~40 mg/L逐渐增加，逐级筛选转基因植株的效果最佳。李文兰等(2010)在罗汉果的遗传转化中则将浓度分为两个阶段，不定芽分化时Hyg的浓度为25 mg/L，不定根分化的浓度为10 mg/L。而唐亚萍等(2012)研究表明，当潮霉素为8 mg/L时，即能抑制雪莲愈伤组织的生长，又不会导致愈伤组织的死亡。而本研究仅研究了韭菜根尖诱导愈伤的最佳浓度，而韭菜愈伤组织分化及不定芽生根对Hyg的选择压有待进一步研究。

2.2抑菌抗生素在韭菜转化中的作用
农杆菌介导转化中，农杆菌侵染外植体共培养后，表面依然附着农杆菌，常使用抗生素抑制其继续生长。但抑菌抗生素对植物组织也有毒害作用，为减小对外植体分化的影响而进行抗生素种类和浓度的筛选。张松等(2003b)对韭菜根尖的抗性进行研究表明，Cef对根尖培养植株再生的抑制作用明显，而选择500 mg/L Timentin作为杀菌剂。曾千春等(2003)对籼稻转化系统优化中去除农杆菌中也表明，Timentin的杀菌效果更好，低浓度条件下(250 mg/ L)即可除菌，而Cef的浓度为500 mg/L时才能抑制菌株生长。Zheng等(2004)在洋葱和韭葱的转化中使用400 mg/L Cef抑制农杆菌，而Eady等(2005)在韭葱和大蒜幼胚的转化中使用200 mg/L Timentin作为抑菌剂，Kenel等(2010)在大蒜的遗传转化中也使用了该浓度。本研究中Timentin和Cef的最佳浓度为400 mg/L，而Cef对韭菜愈伤组织分化的抑制作用不明显，更适合作为韭菜转化的抑菌性抗生素，我们也分两个阶段对其进行研究使试验更加完善。

3材料与方法
3.1材料
研究采用韭菜品种“汉中冬韭”购于山西省侯马市农人种业有限公司。

3.2培养基
本研究采用的基本培养基为MS和1/2MS，含30 g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂和各种相应的激素，pH值为5.8。121℃高压灭菌20 min。具体配方参照张学智等(2013)论文进行，如下：(1)播种培养基：1/2MS；(2)诱愈培养基：MS+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA；(3)诱芽培养基：MS+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT；(4)生根培养基：1/2MS+0.3 mg/L IAA。

3.3韭菜胚根尖培养及愈伤组织诱导
将韭菜种子冲洗干净，在75%乙醇中消毒30 s，无菌水冲洗3~5次，再用含0.1%升汞和0.1% Tween20的混合溶液中消毒10 min，无菌水冲洗3~5次；消毒后的种子放置在播种培养基中，黑暗环境生长2 d后，转移到光照条件下培养。7 d左右，种子萌发生长获得1 cm左右无菌胚根。切去胚根尖1.5~2mm放置诱愈培养基中40 d左右后得到愈伤组织。

3.4选择性抗生素对韭菜再生的影响
3.4.1韭菜对草丁膦(PPT)抗性的筛选
PPT对韭菜愈伤组织诱导不定芽的影响。将愈伤组织切成2 mm大小，放入分别含0、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、1.0 mg/L、1.2 mg/L和1.5 mg/L PPT的诱芽培养基中，研究愈伤组织生长及诱导不定芽的情况，每5 d观察愈伤的生长情况，20 d后统计不定芽分化率及愈伤褐化率。

PPT对韭菜不定芽生根的影响。切取5 cm大小的不定芽，放入分别含0、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L和1.0 mg/L PPT的生根培养基中，研究不定芽的分化情况，每5 d观察植株及根系的生长情况，20 d后统计生根率。

3.4.2韭菜对潮霉素(Hyg)抗性的筛选
将1.5~2 mm的韭菜胚根尖分别接种到含0、1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L和80 mg/L潮霉素的诱愈培养基中。每个处理5瓶，每瓶5个外植体，试验重复3次，培养20 d后，统计试验结果。

3.5抑菌剂对韭菜再生的影响
3.5.1头孢霉素抑菌浓度的筛选
Cef对韭菜愈伤组织诱导不定芽的影响。将韭菜愈伤组织切为2 mm的小块，接种在分别含0、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、350 mg/L、400 mg/L、450 mg/L和500 mg/L Cef的诱芽培养基中，每5 d观察一次愈伤组织的分化情况，20 d后观察统计愈伤组织褐化率和不定芽分化率。

Cef对韭菜不定芽的生根影响。切取5 cm大小的不定芽，放入含头孢霉素(同上)的生根培养基中，每5 d观察观察植株及根系的生长情况，20 d后统计不定芽的生根率。

3.5.2 Timentin抑菌浓度的筛选
以韭菜胚根尖(1.5~2 mm)作为外植体，分别接种到含0、200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L和800 mg/L Timentin的诱愈培养基中。每个处理5瓶，每瓶5个外植体，试验重复3次，培养20 d后，统计出愈率。

作者贡献
侯雷平是项目的负责人，高行英是本研究的实验设计和实验研究的执行人，李梅兰和王婷婷帮助进行了实验的构思、数据的分析和文稿的校对，并在实验过程中提供了一些帮助。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
 本研究由山西省农业科技攻关项目(20090311022; 20110311015-1)和省人事厅人才引进项目共同资助。在本研究的过程中得到付超的热情帮助，在此表示感谢。

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