苹果是世界性果树，其产量名列果品的前三名。中国是苹果生产大国，面积和产量均居世界第一位。目前苹果生产中的品种大多数是二倍体，但是为数不多的多倍体品种(特别是三倍体品种)却表现非常优良。三倍体苹果与二倍体苹果相比，具有适应性高，结实规律，商品价值高(如外观, 果个, 耐贮, 营养高等)等优点(Sedov et al., 2009)，目前已经成为苹果育种工作的重要组成部分。培育三倍体苹果的方法很多，但是常规的诱变方法由于果树本身的栽培周期问题具有一定的困难，且真正倍性一致的材料培育率低，实践证明，二倍体与四倍体相互杂交是获得三倍体的重要方法。目前，俄罗斯育种专家已经通过采用二倍体苹果与四倍体苹果正反交获得了一部分三倍体苹果品种(Sedov et al., 2009)。

分子标记技术已经广泛应用于苹果研究中，在苹果的品种鉴定以及遗传研究中起到非常重要的作用。已见报道的应用于苹果上的主要分子标记有RFLP (Nybom and Schaal, 1990; Jarausch et al., 2000)、RAPD (Koller et al., 1993; Goulἅo and Oliveira, 2001)、AFLP (Goulἅo and Oliveira, 2001; Kenis and Keulemans, 2005)、SSR (Guilford et al., 1997; Goulἅo and Oliveira, 2001)和ISSR (Goulἅo and Oliveira, 2001; He et al., 2011)等。ISSR以及AFLP分子标记技术可以在基因组DNA序列未知的情况下对基因组DNA进行检测，而且具有高灵敏度，较好的重复性，能够为基因组研究提供丰富的信息(马丹炜等, 2006)。通过杂交来选育优良的三倍体苹果品种(系)，亲本的选择及杂交后代的筛选是非常重要的，研究杂交后代及其亲本之间的遗传变异具有重要的研究意义。因此，本研究利用ISSR及AFLP分子标记对通过苹果二倍体‘寒富’与四倍体‘四倍体嘎拉’杂交获得的三倍性后代进行研究，来探讨三倍性杂种后代及其亲本的遗传变异，为三倍体苹果育种提供依据。

1结果与分析
1.1三倍性新种质及其亲本的ISSR分析
本研究共选用12条ISSR引物对7份三倍性新种质及其亲本进行了分析，部分扩增图谱见图1。表1为ISSR的扩增结果，12条引物共扩增出110条带，其中多态性条带为72条。12条引物扩增条带数为7~13条；多态性比例为40.0%~90.0%。其中UBC848扩增条带数最多，为13条。

图1 部分ISSR引物扩增图谱UBC836 (A)和UBC841 (B) 注: M: DL2000 maker; 1: H4G1; 2: H4G2; 3: H4G4; 4: H4G5; 5: H4G6; 6: H4G8; 7: H4G9; 8: ‘寒富’; 9: ‘四倍体嘎拉’ Figure 1 Electrophoresis patterns amplified with primers UBC- 836 (A) and UBC841 (B) Note: M: DL2000 maker; 1: H4G1; 2: H4G2; 3: H4G4; 4: H4G5; 5: H4G6; 6: H4G8; 7: H4G9; 8: ‘Hanfu’; 9: ‘4xGala’

表1 11条ISSR引物及扩增结果 Table 1 11 ISSR primers and amplification results

1.2三倍性新种质及其亲本的AFLP分析
用筛选出的9对EcoRⅠ/MseⅠ引物组合，对供试材料基因组DNA进行扩增，部分扩增图谱见图2。表2为9对AFLP引物组合的扩增结果，在7份三倍性杂交新种质及其亲本中共扩增得到257个位点，其中多态性位点数为195个，占扩增总位点数的75.9%；平均每个引物为28.6个扩增位点和21.7个多态性位点，多态性丰富。不同引物组合的多态位点百分率相差较大，从57.1%到100%不等，其中E32M62这个引物多态性位点百分率最高，达到100%，而产生位点数最低的为E35M47，为57.1%。上述结果说明 ‘寒富’与‘四倍体嘎拉’的自然杂交后代在基因组DNA水平上具有较高的多态性。

图2 部分引物扩增图谱E35M49 (A)和E38M59 (B) 注: 1: H4G1; 2: H4G2; 3: H4G4; 4: H4G5; 5: H4G6; 6: H4G8; 7: H4G9; 8: ‘寒富’; 9: ‘四倍体嘎拉’ Figure 2 Electrophoresis patterns amplified with primer E35M49 (A) and E38M59 (B) Note: 1: H4G1; 2: H4G2; 3: H4G4; 4: H4G5; 5: H4G6; 6: H4G8; 7: H4G9; 8: ‘Hanfu’; 9: ‘4xGala’

表2 9对AFLP引物选择性扩增结果 Table 2 AFLP amplified results based on 9 primers selected

1.3供试材料的ISSR与AFLP遗传多样性比较
表3为ISSR和AFLP扩增得到的遗传多样性参数，其中子代ISSR扩增多态性比率为60.00%，有效等位基因数Ne为1.420，Nei's基因多样性指数H为0.236，Shannon信息指数I为0.346。AFLP扩增的多态性比率为66.54%，Ne为1.421，H为0.240，I为0.357。从表4可以看出，AFLP扩增得到的遗传多样性指数PPB、Na、Ne、H和I值均大于ISSR扩增的结果。说明AFLP与ISSR相比可以检测到更高的多态性。

表3 7份三倍性新种质及其亲本ISSR和AFLP扩增比较 Table 3 Comparison of genetic diversity of 7 hybrids and parents revealed by ISSR and AFLP

1.4供试材料的遗传相似性系数
对这7份三倍性新种质及‘寒富’和‘四倍体嘎拉’运用NTSYS计算得到其Jaccard's相似系数。表4和表5分别为基于ISSR和AFLP分子标记的遗传相似系数。由表4可知，由ISSR扩增得到的三倍性新种质与母本‘寒富’的相似系数在0.590 9~0.769 2之间，其中H4G4与‘寒富’的相似系数最大，为0.769 2；H4G1的相似系数最小，为0.590 9。与父本‘四倍体嘎拉’的相似系数在0.571 4~0.750 0之间，其中H4G6的相似系数最大，为0.750 0，H4G1的相似系数最小，为0.571 4。

表4 7份三倍性新种质与亲本之间的相似系数(ISSR) Table 4 Similarity of 7 triploid hybrids and their parents based on ISSR

由表5可知，这7个三倍性新种质与母本‘寒富’的相似系数在0.580 0~0.638 3之间，其中H4G6与‘寒富’的相似系数最大，为0.638 3；H4G1的相似系数最小，为0.580 l。与父本‘四倍体嘎拉’的相似系数在0.516 9~0.595 3之间，其中H4G4的相似系数最大，为0.595 3；H4G1的相似系数最小，为0.516 9。从表中的遗传距离可以看出，这7份新种质与母本‘寒富’之间的相似系数大于与父本‘四倍体嘎拉’的相似系数。

表5 7个三倍体新种质与亲本之间的相似系数(AFLP) Table 5 Similarity of 7 triploid hybrids and their parents based on AFLP

1.5供试材料的聚类分析
图3中，A图为ISSR分子标记得到的UPGMA聚类图，B图为运用AFLP分子标记得到的聚类图，C图为ISSR与AFLP两种分子标记相结合得到的UPGMA聚类图。聚类结果显示，在这两种标记方法中，H4G4和H4G6可以在一起，H4G5与其他试材关系是最远的。但是这两种标记也存在一定的差异，由ISSR得到的聚类图中H4G2和H4G9最先聚为一类，而由AFLP得到的聚类图中，H4G9和H4G8最先聚为一类。在由两种标记相结合得到的聚类结果显示，H4G9和H4G8最先聚为一类，其次H4G2与H4G9和H4G8聚为一类。由图A和B图均可以看出，除H4G5外，其他6份三倍性杂交后代与‘寒富’的可以聚在一起，而根据两种标记相结合得到的聚类图可以看出，所有的试材均先与母本‘寒富’聚为一类，其次再与父本‘四倍体嘎拉’聚为一类，因此可以推测‘寒富’与‘四倍体嘎拉’的杂交后代遗传倾向于母本‘寒富’。

图3 供试试材的UPGMA聚类图 注: A: ISSR聚类结果; B: AFLP聚类结果; C: ISSR和AFLP结合聚类结果; 1: 寒富; 2: H4G4; 3: H4G6; 4: H4G1; 5: H4G2; 6: H4G9; 7: H4G8; 8: 四倍体嘎拉; 9: H4G5 Figure 3 UPGMA dendrograms of 9 varieties based on Jaccard's coefficients, using ISSR (A), AFLP (B) and both (C) Note: A: UPGMA dendrograms based on ISSR; B: UPGMA dendrograms based on AFLP; C: UPGMA dendrograms based on ISSR and AFLP; 1: Hanfu; 2: H4G4; 3: H4G6; 4: H4G1; 5: H4G2; 6: H4G9; 7: H4G8; 8: 4xGala; 9: H4G5

2讨论
本研究结果表明，AFLP对多态性位点的检出率高于ISSR，由AFLP标记获得的遗传多样性指数均高于ISSR标记。曾艳等(2011)通过ISSR和AFLP标记对水仙属植物研究发现，AFLP标记多态性高于ISSR标记。这与本研究的结果是一致的。由表4可以看出AFLP和ISSR结果中的Na、Ne、H和I的标准差数值接近，说明这两种标记估算遗传多样性时的精确度相差不大。由此可以看出，这两种标记均能在一定程度上反映出这7份三倍性杂种后代及其亲本的遗传变异情况，这与前人研究结果一致(Goulἅo and Oliveira, 2001)。同样，两种标记结果存在一定的差异，主要可能有以下几方面原因：一是两种标记的原理不一样，ISSR是检测基因组中的重复序列间片段，而AFLP则检测的为特异限制性片段；二是AFLP的结果是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，可以得到更多的条带；三是ISSR和AFLP的引物不同，因此检测到的多态性存在一定的差异，而且随着引物的增加，多态性片段同时增加，遗传距离也随之改变(马丹炜等, 2006)。相比较而言，AFLP的遗传多样性指数高于ISSR，而在研究植物的遗传多样性时，所用分子标记越灵敏，越有利于对其遗传背景进行分析。因此，在分析这7份三倍性杂种后代及其亲本的遗传变异方面，AFLP与ISSR相比更有效。

不同倍性间杂交除了可以创造具有不同倍性水平的杂交后代外，更多的是能够从基因组遗传变异上进行种质创新(饶静云等, 2012)，通过两个基因组的融合或重组，基因组和(或)转录组产生大量变异，从而导致表现的改变和生态适应性的出现(Adams and Wendel, 2005)。饶静云等(2012)对8个中华猕猴桃杂交组合群体子代倍性分离及遗传分化规律研究表明，相比亲本，所有具有不同倍性的杂交后代均出现了不同水平的基因组特异性条带，而且同一倍性的后代数量越多出现特异条带的几率越大。边禹等(2010)运用AFLP对不同倍性的‘早红3号’枇杷基因组分析表明，三倍体和四倍体与二倍体相比均有特异片段的增加和消失。同样在小麦的异源多倍体中也发生了序列变异(邱天和庞劲松, 2011)。在本研究的两种分子标记结果中，杂交后代均存在一定的条带消失或出现特异性条带的情况，说明三倍性杂交后代中出现了基因组序列的调整。在表型上，这7份苹果三倍性杂交后代与父母本相比均表现出植株高大，生长旺盛，叶色浓绿、花粉育性下降等特点，但是这些表型的差异是否与基因组序列调整有关，还有待进一步的研究。

3材料与方法
3.1材料
试材来自山东省肥城市安驾庄镇山东省果树研究所试验基地，是以‘寒富’(2n=2x=34)为母本，‘四倍体嘎啦’(2n=4x=68)为父本，人工授粉获得的7份三倍性新种质(2n=3x=51) H4G1，H4G2，H4G4，H4G5，H4G6，H4G8和H4G9 (李林光, 2008)。上述试材嫁接于基砧为八棱海棠，中间砧为M₂₆后，于2007年春季定植，架式栽培，常规管理。

3.2方法
3.2.1三倍性新种质及其亲本DNA提取
于2012年4月初，取上述材料幼嫩叶片1 g左右，用冰盒迅速带回试验室，采用天根新型植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取DNA，-20℃保存备用。

3.2.2 三倍性新种质及其亲本的ISSR分析
所用ISSR引物序列(表1)参照哥伦比亚大学公布序列，由北京赛百盛公司合成。PCR体系及扩增程序参照宣继萍和章镇(2002)的方法进行优化，PCR体系各组分浓度为：1×PCR Buffer，0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl₂，1 U Taq DNA聚合酶(Takara)，0.5 μmol/L引物和50 ng/μL基因组DNA，加水补足至20 μL。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，紫外分析仪观察，拍照，并记录结果。设3个重复，选择重复性比较好的分析。

3.2.3三倍性新种质及其亲本的AFLP分析
AFLP分析参照Vos等(1995)的方法并稍微改进，采用EcoRⅠ和MseⅠ两种限制性内切酶(NEB)，37℃酶切6 h，65℃灭活10 min，16℃连接过夜；连接产物稀释后为预扩增模板，预扩增引物采用E00/ M00引物组合；预扩增产物稀释20倍后作为选择性扩增模板，选择性扩增引物采用(E+3)/(M+3)组合。选择性扩增产物变性后用6%的变性聚丙烯酰胺胶电泳检测，采用银染法染色。接头和引物序列见表6。

表6 AFLP接头与引物序列 Table 6 Adapters and primers of AFLP technique

3.2.4数据处理与聚类分析
对所得的琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶电泳图进行条带统计，“1”为有带，“0”为无带。根据所得数据计算所用试材的多态性位点比率，用NTSYS 2.10e计算各试材之间的遗传相似系数(J)，聚类分析采用非加权类平均法(UPGMA)，绘制7份三倍性子代与亲本间的亲缘关系图；采用Popgene32计算7份三倍性杂交子代的遗传多样性指数，包括多态性位点百分率(PPB)、观察等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei基因多样性(H)和Shannon信息指数(I)。

作者贡献
王玉霞、李林光、董文轩是本研究的实验设计和实验研究的执行人；王玉霞、张丽杰完成数据分析，论文初稿的写作；何平参与实验设计，研究结果分析；李林光、董文轩是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本文研究是由国家科技支撑项目(2013BAD02B01)和山东省农业良种工程项目共同资助。

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