光合作用是作物产量形成的物质基础，植物干重90%以上的有机质都是通过光合作用碳同化并转化而成的。根据最初光合产物的不同，高等植物分为C₃、C₄和CAM植物(Moore, 1982)。由于C₄植物具有较高的光合速率、水分和氮素利用效率以及较高的生物产量，特别是在低CO₂浓度、高温、强光和干旱等逆境条件下表现突出(周宝元等, 2011)。因此，通过基因工程手段将C₄植物的高光效特性转移到C₃作物中，实现C3作物光合途径的C₄化，对提高C₃作物光能利用率和产量潜力具有重要的理论价值和现实意义。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)和磷酸丙酮酸二激酶(pyruvate orthophosphate dikinase, PPDK)是C₄途径的两个关键酶(Ku et al., 1999; Usuda et al., 1984)，PEPC与PPDK的转基因一直是研究热点(Mann, 1999a; 1999b; Hu et al., 2012; 张建红等, 2012; 吴琼等, 2011; Wang et al., 2012; Agarie et al., 2002; 张边江等, 2008; Fahnenstich et al., 2007)。通过转基因手段将玉米PEPC与PPDK基因导入C₃植物中，以提高其光合速率进而改善其产量性状的研究已有多例报道(Hu et al., 2012; 吴琼等, 2011; Wang et al., 2012; 张边江等, 2008)。当前转PEPC与PPDK基因是否能增加光合及产量说法不一(Huang et al., 2013; Fukayama et al., 2003; Miyao, 2003)，而本实验室从分子杂交、光合特性，酶活性及产量性状等(Hu et al., 2012; 张建红等, 2012; 吴琼等, 2011; Wang et al., 2012)方面已证实转玉米PEPC基因植物有提高光合效率和改善产量结构的潜能。

干旱胁迫引起气孔关闭，降低碳同化速率，破坏叶绿素结构，造成光合机构吸收的光能过剩，产生光抑制甚至光破坏(Dale and Milthorpe, 1983; Legg et al., 1979)，致使光合速率下降，最终导致减产。近期，对转C₄高光效基因的逆境分子生物学研究成为新的焦点。研究表明，在43℃的高温条件下转PEPC水稻较对照有更高的光合速率(Bandyopadhyay et al., 2007)，干旱和盐胁迫可诱导提高PEPC在拟南芥中的表达(Sanchez et al., 2006)，转玉米PPDK基因水稻较对照有更高的光合同化速率(Zhang et al., 2010)，转PPDK烟草可通过调节有机酸代谢减轻土壤中铝的毒害作用(Trejo-Téllez et al., 2010)。为探究在干旱胁迫下PEPC与PPDK基因对C₃植物的生理调节机理，本研究以转玉米C₄型PEPC、PPDK和PEPC+PPDK基因T₆代拟南芥为材料，对比研究了干旱胁迫条件下转基因拟南芥生理特性的变化，以期探索作物抗逆育种的新途径。

1结果与分析
1.1转基因拟南芥阳性株系的鉴定
利用PCR方法对获得的转基因株系PC90、PC73、PK17、PK26和PCK110进行鉴定，在加入特异引物扩增时，分别得到预计的PCR产物片段，即PEPC为667 bp，PPDK为733 bp。结果表明，PEPC、PPDK及PEPC+PPDK基因均分别整合到了拟南芥基因组中(图1)。

图1 转基因拟南芥的PCR分析 注: M: DL2000 marker; +: 质粒p3301-PEPC, 质粒p3301-PPDK; -: 野生型植株GLC; 1~5: 转基因株系, 分别为PC90, PC73, PK17, PK26, PCK110 Figure 1 PCR analysis of transgenic Arabidopsis Note: M: DL2000 marker; +: Plasmid p3301-PEPC, plasmid p3301-PPDK; -: Wild plant GLC; 1~5: Transgenic plant, PC90, PC73, PK17, PK26, PCK110, respectively

1.2转基因拟南芥对干旱的反应
1.2.1模拟干旱胁迫对转基因拟南芥幼苗生长的影响
图2为胁迫条件下转基因和野生型幼苗的生长状况，由图可知在正常条件下转基因和野生型拟南芥幼苗生长状况良好，且各基因型间的生长状况无显著差异。干旱胁迫抑制拟南芥幼苗的生长发育，250 mmol/L甘露醇比150 mmol/L甘露醇对幼苗生长的抑制更大。

图2 甘露醇胁迫下转基因和野生型拟南芥幼苗生长状况 注: A: 1/2MS; B: 150 mmol/L甘露醇; C: 250 mmol/L甘露醇 Figure 2 Growth of transgenic and wild type Arabidopsis seedlings treated with mannitol Note: A: 1/2MS; B: 150 mmol/L mannitol; C: 250 mmol/L mannitol

不同胁迫处理对转基因拟南芥幼苗根长的影响见表1。在不同胁迫处理条件下，各转基因株系的相对根长(胁迫条件下根长/对照条件下根长)均高于对照，其中在150 mmol/L甘露醇处理下PC90的相对根长显著高于对照(p<0.05)，其它各株系的相对根长在150 mmol/L和250 mmol/L甘露醇胁迫处理下，均极显著高于对照(p<0.01)。在胁迫处理条件下转PEPC，PPDK和PEPC+PPDK基因株系的相对根长的平均值分别较对照增加44%,48%和51%，表明逆境条件下转基因植株较野生型具有更快的生长速度，转PEPC+PPDK基因株系在逆境条件下的生长速度快于转PEPC基因株系和PPDK基因株系。

表1 甘露醇胁迫下转基因和野生型拟南芥幼苗相对根长 Table 1 Relative root length of transgenic and wild type Arabidopsis seedlings treated with mannitol

1.2.2转基因拟南芥成株抗旱性鉴定
干旱处理25 d后，所有基因型株系幼苗均萎蔫，呈枯死状，复水5 d后部分干枯拟南芥又呈现复活状(图3)。然而，转基因株系的死亡率均极显著低于对照(图4)，其中转PEPC基因株系PC90和PC73的死亡率分别为13.3%和11.3%，分别为对照死亡率的15.4%和13.1%；转PPDK基因株系PK17和PK26的死亡率分别为16.7%和10.0%，分别为对照死亡率的19.2%和11.5%；转PEPC+PPDK基因株系PCK110的死亡率为6.7%，为对照死亡率的7.7%。以上结果表明，PEPC和PPDK基因均可提高拟南芥的抗旱能力，单基因株系间略有差异，转PEPC+PPDK基因拟南芥株系较转PEPC或PPDK基因拟南芥株系具有更强的抗旱性。

图3 干旱胁迫下转基因拟南芥生长状况 Figure 3 Growth of transgenic and wild type Arabidopsis treated with drought stress

图4 干旱胁迫下转基因拟南芥的死亡率 注: **: p<0.01 Figure 4 Death rate of transgenic and wild type Arabidopsis under drought stress Note: **: p<0.01

1.3干旱胁迫下转基因拟南芥可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛含量
在干旱胁迫条件下转PEPC基因的两个单基因株系可溶性糖和可溶性蛋白含量与野生型没有显著性差异，其丙二醛含量较对照有所降低；转PPDK基因株系可溶性糖和可溶性蛋白含量较对照均升高，其丙二醛含量较对照较低，其中PK26在可溶性糖和可溶性蛋白上的增量和在丙二醛上的减少量方面均比PK17更明显；转PEPC+PPDK基因株系PCK110的可溶性糖和可溶性蛋白含量较对照升高，丙二醛含量较对照降低，且均有显著性差异(p<0.05) (表2)。转PPDK基因株系较转PEPC基因株系在可溶性糖和可溶性蛋白含量上有所升高，其丙二醛含量降低；转PEPC+PPDK基因株系比转PEPC或PPDK基因株系在可溶性糖和可溶性蛋白的增加量和在丙二醛的减少量上更明显。

表2 干旱胁迫下转基因拟南芥可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛含量 Table 2 The contents of soluble sugar, soluble protein and malondialdehyde in transgenic Arabidopsis under drought stress

1.4干旱胁迫下转基因拟南芥叶绿素含量
干旱胁迫条件下野生型和转基因株系叶绿素含量均较对照降低，在对照和干旱胁迫条件下，转基因株系叶绿素含量均高于野生型(图5)。干旱胁迫条件下野生型叶绿素含量降低幅度最大为61%，PCK110最小，为52%，转PCPC、PPDK、PEPC+PPDK基因株系叶绿素相对含量分别较对照增加13%、15%和23%。表明转基因植株在逆境胁迫下的光合机构数量较野生型更丰富，且转PEPC+PPDK双基因株系优于转PEPC基因株系或PPDK基因株系。

图5 干旱胁迫下转基因和野生型拟南芥叶片叶绿素含量 Figure 5 Chlorophyll content in transgenic and wild type Arabidopsis under drought stress

1.5干旱胁迫下转基因拟南芥叶绿素荧光参数
初始荧光(F₀)，是光系统Ⅱ (PSⅡ)反应中心(经过充分暗适应以后)处于完全开放时的初始荧光产量。最大荧光(F_m)，是光系统Ⅱ (PSⅡ)反应中心处于完全关闭时的荧光产量，可反映PSⅡ的电子传递情况。最大光化学效率(F_v/F_m)，反映PSⅡ反应中心内原初光能转化效率，表明PSⅡ利用光能的能力。干旱胁迫条件下，各基因型的F₀均增加，F_m和F_v/F_m均降低，且野生型F₀较转基因株系增幅最大，为20.4%，胁迫条件下野生型F_v/F_m最小，为0.78。表明，胁迫条件下野生型PSⅡ反应中心遭破坏或失活最严重，转PEPC或PPDK基因能提高拟南芥的光合潜能与抗水分胁迫能力(图6)。

图6 干旱胁迫对转基因和野生型拟南芥叶绿素荧光参数的影响 Figure 6 Effect of drought stress on chlorophyll fluorescence parameters in transgenic and wild type Arabidopsis

2讨论
玉米等C₄型植物较小麦等C₃型植物具有较高的光合、水分和氮素利用效率与生物产量，特别是在低CO₂浓度、高温、强光、干旱等逆境条件下，C₄植物能抵御逆境胁迫同化CO₂生成较多的有机物，并提高光合效率和改善产量潜力。随着分子生物学和转基因技术的不断发展和完善，已先后获得C₄光合循环关键酶基因，如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC基因)、磷酸丙酮酸二激酶基因(PPDK基因)和依赖NADP的苹果酸酶基因(NADP-ME基因)，并将它们导入C₃植物中，获得高表达转C₄高光效关键酶基因的C3植物(Hu et al., 2012; Wang et al., 2012; 张边江等, 2008; Fahnenstich et al., 2007; Taniguchi et al., 2008)。Hu等(2012)研究表明，转玉米C₄型PEPC基因小麦酶活是对照的140%，光合高达31.95 mol·CO₂·m^-2·s^-1，提高26%；Li和Wang (2013)研究表明，转PEPC基因水稻碳同化能力较对照提高，而且转基因水稻的叶、茎、鞘和穗的干物质重较对照增加；Ku等(2000)发现，转PPDK基因水稻光合能力和田间产量分别提高了35%和30%~35%；Wang等(2012)发现转PEPC基因拟南芥酶活提高5.18倍，光合速率提高36%，转PPDK拟南芥酶活提高4.63倍，光合提高23%，转PEPC+PPDK双基因拟南芥光合提高46%；Taniguchi等(2008)将玉米的PEPC、PPDK、NADP-ME和NADP-MDH导入水稻，发现由于PEPC和NADP-ME的导入可引起水稻的发育迟缓，NADP-MDH可缓解这一现象。本研究表明，在正常条件下，转玉米PEPC和PPDK单或双基因拟南芥在幼苗期的生长状况与野生型相比无明显差异，在150 mmol/L和250 mmol/L甘露醇胁迫条件下转PEPC基因、转PPDK基因和转PEPC+PPDK基因拟南芥株系的平均相对根长和叶绿素含量分别是对照的1.44，1.48， 1.51和1.19，1.20， 1.29倍。初步推测，这可能与PEPC和PPDK基因增强了拟南芥对干旱胁迫的耐性有关。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)作为光合作用中的关键酶，同时还参与氨基酸代谢中碳骨架的回补作用(Leegood, 2002)。研究表明，转蓝藻PEPC基因的野蚕豆种子中的可溶性蛋白含量增加了15%~25% (Rolletschek et al., 2004)；过表达蓝藻PEPC的拟南芥中各种氨基酸含量发生变化(Chen et al., 2004)。周娟(2010)研究表明，转PEPC基因水稻较野生型具有更高的耐盐胁迫能力；周宝元等(2011)研究表明PEPC过表达可以减轻干旱胁迫对水稻光合的抑制作用；丁在松等(2012)研究表明，在干旱胁迫下转PEPC基因水稻抗氧化酶的活性提高，抵御强光胁迫能力增强。本研究表明，在干旱胁迫下，转PEPC基因、转PPDK基因和转PEPC+PPDK双基因拟南芥株系的死亡率平均为12%，13%和7%，极显著低于野生型87% (p<0.01)；可溶性糖和可溶性蛋白最高为对照的1.24和1.15倍；丙二醛最低为对照的84.10%。表明通过转PEPC，PPDK基因可以减少干旱胁迫下脂质过氧化物的积累，减缓干旱胁迫对拟南芥的伤害，与丁在松等(2012)研究结果一致。这可能是由于PEPC和PPDK基因导入，改变了拟南芥体内原有的有机酸代谢，从而影响了氨基酸的生物合成，最终致使其增强了对逆境胁迫的抵抗能力。C₄高光效基因如PEPC和PPDK基因导入后，干旱境胁迫如何增强拟南芥内源逆境相关基因的诱导与表达和影响渗透性物质代谢的分子机制,尚需进一步研究探讨。

3材料与方法
3.1实验材料
转PEPC基因株系PC90 (PC90-1-2-1-1)、PC73 (PC73-1-3-1-2)；转PPDK基因株系PK17 (PK17-1-2-1-3)、PK26 (PK26-3-2-3-1)；转PEPC+PPDK基因株系PCK110 (PCK110-1-2-1-1)和野生型(GLC)拟南芥株系均由河南省农业科学院小麦研究所分子育种室提供。实验材料种植于河南省农业科学院小麦研究所人工气候室，光照为100 μmol·m^-2·s^-1，湿度为70%。

3.2研究方法
3.2.1转基因拟南芥阳性株系的鉴定
参照Wang等(2012)的方法，用SDS法小量提取拟南芥基因组DNA。根据玉米C₄型PEPC (GeneBank:FJ415327)和PPDK (GenBank:GU363532)基因序列，用Primer Premier5.0软件设计特异引物LP1：5'-TGGAAGGGCGTGCCTAAGTT-3'；LP2：ATGCCGAGGTGCGTGGTGAT-3'和PPDK2JF：5'-TCATTGCCACTGGTCTGC-3'；PPDK2JR：5'-TCCTCGATGTTCCCTTCTG-3'。引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成，扩增的目的片段大小分别为667 bp和733 bp。

3.2.2转基因拟南芥抗旱性鉴定
3.2.2.1转基因拟南芥幼苗模拟抗旱性鉴定
以1/2MS固体培养基为对照，添加甘露醇模拟干旱胁迫。在24℃，12 h/22℃，12 h (白天/黑夜)条件下，1/2MS固体培养基上培养T₆代转基因PC90、PC73、PK17、PK26，PCK110和野生型GLC拟南芥植株。7 d后移至分别含有150 mmol/和250 mmol/L甘露醇的1/2MS固体培养基上,同样条件下培养8 d。参照陈吉宝(2008)的方法测定转基因拟南芥幼苗相对根长。

3.2.2.2转基因拟南芥成株抗旱性鉴定
将在1/2MS培养基上生长7 d的转基因(PC73, PC90, PK17, PK26, PCK110)和野生型GLC拟南芥幼苗移至装有定量营养土的营养钵中，每钵移栽5株，在24℃，12 h/22℃，12 h (白天/黑夜)，70%的湿度条件下缓苗15 d后进行胁迫处理，每组每个株系3钵，重复3次。干旱胁迫处理控水措施为停止浇水培养25 d，然后复水培养5 d，统计幼苗的死亡率，对照组(CK)为水培。

3.2.3可溶性糖、可溶性可溶性蛋白和丙二醛(MDA)含量的测定
在停止浇水15 d后取样，可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛的提取参照王学奎的方法(王学奎, 2006, 高等教育出版社, pp.186-281)，其中可溶性糖含量选用蒽酮法，叶片可溶性蛋白含量选用Bradford法，丙二醛含量按王学奎的方法进行测定(王学奎, 2006, 高等教育出版社, pp.186-281)。

3.2.4叶绿素含量及叶绿素荧光参数的测定
在停止浇水15 d后取对照与胁迫各基因型株系莲座叶叶片，剪碎混匀，称取0.2 g，重复3次，置于含5 mL 80%丙酮的试管中，封管口后避光过夜，至叶片完全脱色后取上清液用UV-2800AH型紫外分光光度计(UNICO)在663 nm和645 nm波长处测其吸光值。按Arnon (1949)的公式计算叶绿素含量。 

在停止浇水15 d后，参照Genty等(1989)的方法，利用FMS-2脉冲调制式荧光仪(HANSATECH, UK)测定对照与胁迫各基因型株系莲座叶片叶绿素的初始荧光(F₀)、最大荧光(F_m)和PSⅡ的最大光量子效率(F_v/F_m)，各基因型株系重复5次。测定前叶片暗适应30 min。

3.2.5数据统计分析
本研究实验数据分析应用Microsoft Excel，DPS分析程序。

作者贡献
杜西河是本研究的实验设计和实验研究的执行人，并完成数据分析，论文初稿的写作；胡琳、张磊、李艳、齐学礼、王会伟和王玉民参与实验设计，试验结果分析；许为钢是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家科技支撑计划项目资助(2011B- AD07B01)、现代农业产业技术体系专项资金资助(C-ARS-3-1-9)、国家转基因生物新品种培育科技重大专项资助(2011ZX08002-003)、国家自然科学基金项目资助(30971785)共同资助。

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