小麦白粉病(Erysiphe graminis f. sp. tritici)是由小麦白粉病菌引起的一种世界性真菌病害(Bennett, 1984; 郝元峰, 2008)。随着小麦生产条件的改善，群体密度的加大和氮肥施用量的增加，白粉病发病范围不断扩大，危害程度也在不断加重。白粉病已成为影响小麦高产稳产的重要因素之一。迄今在小麦种内和小麦近缘种属中已发现并定位了58个小麦抗白粉病主效基因，它们分布在41个位点上，编号从PM1到PM45 (Hsam et al., 2003; Ma et al., 2011; 徐金秋等, 2012)，但在生产中能够有效利用的抗性基因则较少。由于小麦白粉病病原菌生理小种多，毒力变异快，且白粉病菌往往会随着寄主抗性基因的选择作用而发生协同进化，从而克服抗性基因，导致小麦品种的白粉病抗性丧失(詹海仙等, 2010)。因此不断发掘新的抗病基因，选育抗病品种是防治小麦白粉病最经济、安全、有效的措施。

分子标记技术已广泛应用于小麦抗病基因定位及遗传图谱的构建(Huang and Röder, 2004; Blanco et al., 2008; 薛飞等, 2012)，特别是SSR标记，因其具有多态性丰富、重复性好、标记呈共显性等特点，已成为抗病基因筛选中的最主要标记之一(Gao et al., 2003; Fu et al., 2006; 李春鑫和许为钢, 2009)。迄今为止，已有上千个SSR标记被定位到小麦遗传图谱上，其中采用SSR标记定位在小麦相应的染色体上的抗白粉病基因已有18个，如PM33、PM34、PM35等(Miranda et al., 2006; 2007)。利用cDNA序列开发的EST标记能更直接的反应基因在染色体上的位置，在基因的标记定位和标记辅助育种中也被广泛应用。

山农3895是本实验室从感白粉病小麦品系山农2618幼胚培养后代中筛选出来的抗白粉病突变体，综合农艺性状良好，多年苗期和成株期接种鉴定结果表明其对白粉病表现为免疫或近免疫。本研究对其白粉病的抗性遗传特点进行了分析，利用分子标记技术对其抗白粉病基因进行了染色体定位。

1结果与分析
1.1山农3895抗白粉病基因的遗传分析
利用白粉菌E09生理小种苗期接种鉴定结果表明，山农3895表现为免疫(反应型为0级)，感病亲本辉县红表现为高感(反应型为4级)，山农3895/辉县红F₁表现为免疫或近免疫(反应型为0级或0;级)；在调查的196株山农3895/辉县红F₂植株中有148株表现为抗病(反应型为0级或0;级)，48株表现为感病。经χ2检验(χ²=0.02, χ²_0.05,1=3.84)，抗感分离符合3:1的分离比例。

在温室成株期抗性鉴定结果表明，抗病亲本山农3895和感病亲本辉县红分别表现为免疫(反应型为0级)和高感(反应型为4级)，山农3895/辉县红F₁表现为免疫(反应型为0级)，同抗病亲本表现一致；在调查的539株F₂植株中，388株表现抗病(反应型为0级或0;级)，151株表现感病。经χ²检验(χ²=2.61, χ²_0.05,1=3.84)，抗感分离符合3:1的分离比例。

苗期和成株期白粉病抗性鉴定结果列于表1。综合苗期和成株期的抗性鉴定结果可以看出，山农3895是一个全生育期高抗白粉病的种质系，且其抗性是由1对显性主效基因控制，暂命名为PML3895。

表1 白粉病抗性鉴定结果 Table 1 The result on the resistance test of powdery mildew

1.2山农3895抗白粉病基因的分子标记筛选
选用分布在小麦全基因组上的2 750对SSR、EST-SSR和STS引物分别对苗期和成株期两亲本进行筛选，得到489对引物能在双亲间揭示多态性差异。进一步利用优选小群体对得到的489对引物进行筛选，结果获得3个EST-SSR标记CWM109、Xcnl113和SWE231，它们在苗期和成株期的优选小群体中均能揭示多态性差异(图1)。为验证这3个标记是否与抗病基因紧密连锁，利用苗期F₂群体的196个单株进行连锁分析，结果发现3个标记均与PML3895连锁。利用成株期包含539个单株的F₂群体进行分析的结果与苗期结果一致，3个标记在成株期F₂群体中均与抗病基因表现紧密连锁，其电泳扩增结果如表2。利用成株期F₂分离群体和JoinMap4.0分析计算标记与抗病基因PML3895之间的距离，结果表明3个标记CWM109、Xcnl113和SWE231与抗病基因间的遗传距离分别为0.6 cM、2.6 cM和2.8 cM，利用MapDraw软件绘制出抗病基因与3个标记的遗传连锁图谱，其中标记CWM109和SWE231位于PML3895的同一侧，标记Xcnl113位于PML3895的另一侧(图2)。

图1 标记CWM109 (A), Xcnl113 (B)和SWE231 (C)的PCR扩增结果 注: M: DL2000 marker; P1: 山农3895; P2: 辉县红; R: 抗病单株; S: 感病单株; 箭头指示多态性片段 Figure 1 Amplification products of 15 typical resistant individuals and 15 typical susceptible individuals in F2 by CWM109 (A), Xcnl113 (B) and SWE231 (C) Note: M: DL2000 marker; P1: Shannong3895; P2: Huixianhong; R: Resistant plants; S: Susceptible plants; The arrow indicates the polymorphic DNA fragments

表2 EST-SSR标记在山农3895/辉县红成株期F2群体中的分离 Table 2 The segregation of EST-SSR makers in Shannong3895/ Huixianhong F2 population of the adult stage

图2 抗白粉病基因ML3895分子标记连锁图谱 Figure 2 Linkage map of PML3895 mapped in the F2 population

1.3抗白粉病基因的染色体定位
根据Yu等(2004)发表的微卫星图谱，标记Xcnl113已被定位在小麦6B染色体上。利用与抗病基因PML3895紧密连锁的标记Xcnl113在中国春缺体-四体系进行扩增，结果发现标记Xcnl113在中国春缺体-四体系N6B-T6A上未扩增出特异谱带，而在中国春及其他缺体-四体系中均能扩增出250 bp的特异谱带(图3)，进一步证明标记Xcnl113位于6B染色体上。依据前面的连锁分析结果，标记Xcnl113与CWM109、SWE231和PML3895表现紧密连锁，因此可将抗白粉病基因PML3895定位于6B染色体上。

图3 标记Xcnl113在中国春缺体-四体系中的扩增结果 注: M: DL2000 marker; P1: 山农3895; P2: 辉县红; 箭头指示多态性片段 Figure 3 Amplification pattern of Xcnl113 in Chinese Spring nullisomic-tetrasomic Note: M: DL2000 marker; P1: Shannong3895; P2: Huixianhong; The arrow indicates the polymorphic DNA fragments

1.4分子标记的验证
为了验证与抗病基因连锁的标记的可靠性，在F₂分离群体中选取10株典型抗病单株和10株典型感病单株种成F_2:3家系，进一步对其进行抗病性鉴定和标记验证。结果表明，10株典型抗病单株F_2:3家系对白粉病均表现为免疫或接近免疫，10株感病单株F_2:3家系对白粉病均表现为高感，与抗病基因连锁的3个标记CWM109、Xcnl113和SWE231也均能扩增出相应的特异谱带，从而证明3个标记的可靠性。图4为标记CWM109在部分F_2:3家系中的扩增结果。

图4 WMC109在亲本及部分F2:3中的带型检测 注: M: DL2000 marker; P1: 山农3895; P2: 辉县红; R: 抗病单株; S: 感病单株; 箭头指示多态性片段 Figure 4 Amplification products of parents and parts of individuals in F2:3 by WMC109 Note: M: DL2000 marker; P1: Shannong3895; P2: Huixianhong; R: Resistant plants; S: Susceptible plants; The arrow indicates the polymorphic DNA fragments

2讨论
小麦种质山农3895是本实验室从感白粉病的小麦品系山农2618的组培后代中筛选出来的抗白粉病突变体，通过多年鉴定，它对单一白粉病菌种(E09, E15, E20和E22)和田间混合菌种具有良好的抗性，并且综合农艺性状良好，在小麦白粉病抗性遗传改良中具有重要利用价值。

本研究通过遗传分析明确了山农3895的白粉病抗性受1对显性主效基因(PML3895)控制，并利用分子标记技术将其定位在6B染色体上，获得了3个与抗病基因紧密连锁的EST-SSR标记CWM109、Xcnl113和SWE231，它们与抗病基因间的遗传距离分别为0.6 cM、2.6 cM和2.8 cM，可用于标记辅助选择。

迄今为止，已有5个小麦抗白粉病基因被定位于6B染色体上，它们分别为：PM11、PM12、PM14、PM20和PM27 (Jia et al., 1996)。其中PM11和PM14均来源于普通小麦，但二者均不抗小麦白粉病，只抗冰草属白粉病(Tosa et al., 1988; Tosa and Tada, 1990)；谢皓(2005)曾报道，SSR标记Xgwm361与PM12连锁，二者遗传距离为0.9 cM，利用Xgwm361在山农3895和辉县红中进行扩增，结果发现该标记在它们中没有扩增出多态性差异。PM20来自于黑麦，PM27来源于提莫菲维小麦，它们与山农3895的白粉病抗性来源不同；利用Järve等(2000)报道的与PM27共分离的SSR标记Xpsp3131，在山农3895、辉县红和抗感优选小群体中进行扩增，没有发现其与山农3895的白粉病抗性基因PML3895具有连锁关系。综上所述，初步推测PML3895可能不同于6B上已知的白粉病抗性基因，可能是一个新的抗病基因。

3材料与方法
3.1植物材料和白粉病菌
小麦抗白粉病突变体山农3895、高度感染白粉病小麦品种辉县红、山农3895/辉县红F₁、F₁自交获得的F₂分离群体和F_2:3家系，中国春缺体-四体系。以上材料均由山东农业大学国家小麦改良中心泰安分中心提供。

白粉菌种E09、E20由中国农业科学院作物所李洪杰研究员提供。

3.2山农3895抗病基因接种鉴定及遗传分析
苗期鉴定：将亲本、F₁、F₂种植在光照培养箱内，以感病亲本辉县红作为感病对照，待幼苗第一片叶完全展开后用扫拂法接种白粉病生理小种E09，接种后13~15 d待感病品种充分发病时，调查记载发病情况，3 d后复查1次。

成株期鉴定：将供试亲本、F₁、F₂于10月上旬播种在大田，12月上旬移栽于温室，每一亲本和F₁各种两行，每行20株。F₂分离群体每行15株，行长1 m，行距0.25 m，同时将感病对照材料辉县红每隔5行种植于F₂群体中用于诱发白粉病，待感病对照材料充分发病且F₂群体抽穗后进行抗病性调查，7 d后复查1次。

苗期和成株期抗性调查均采用盛宝钦六级分类标准进行(盛宝钦, 1988, 植物保护, pp.49)：0级无可见斑；0; 级有过敏性坏死斑；1级菌丝稀薄可见，产孢量极少；2级病斑直径小于1 mm，菌丝层较厚能产一定量孢子；3级病斑直径大于1 mm，产孢量大菌丝不连片；4级病斑大，菌丝层厚且病斑连片。其中0~2级为抗病；3~4级为感病。根据亲本、F₁植株的抗性表现和F2群体的分离比例，确定抗白粉病基因的遗传特点，用卡方法检测其适合度。

3.3 DNA的提取和优选小群体的构建
利用CTAB法在苗期提取亲本和196株山农3895/辉县红F₂单株的基因组DNA，在成株期提取亲本和539株F2分离群体单株的基因组DNA。采用优选小群体法从F₂分离群体中分别选取15株典型抗病单株(反应型为0级)和15株典型感病单株(反应型为4级)基因组DNA构建抗感优选小群体。

3.4 SSR多态性分析
选取分布在小麦全基因组上的2 750对SSR、EST-SSR和STS引物在亲本间进行多态性筛选，然后利用优选小群体法进一步筛选在亲本间具有多态性的引物，并将优选小群体中得到的多态性引物分别在苗期和成株期F₂群体中进行验证和分析。

PCR反应在Takara PCR thermal cycler上进行，使用降落PCR (Touchdown PCR)，即95℃预变性5 min，然后为每个循环退火温度降低1℃的程序，共进行15个循环，其程序为：94℃变性50 s，65℃复性50 s和72℃延伸1 min；最后30个循环的普通PCR程序为94℃变性50 s，50℃复性50 s，72℃延伸1 min；最后72℃延伸10 min，扩增结束后4℃保存。扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色后利用Tanon Gis-2010凝胶成像仪照相并进行带型统计与分析。

3.5连锁分析
根据F2群体扩增带型数据，采用JoinMap4.0软件进行分析并计算抗病基因与分子标记间的遗传距离，最后利用MapDraw软件在Excel中绘制遗传图谱(刘仁虎和孟金陵, 2003)。筛选出的与抗病基因紧密连锁的分子标记，利用中国春缺体-四体系和已发表的分子标记图谱信息进行染色体定位。

作者贡献
赵虎是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；吴瑕和徐金秋参与实验设计；牛祖彪参与试验结果的分析；王洪刚是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(30971765)资助。感谢李洪杰研究员提供的白粉病E09、E20菌种；感谢张超、张一铎、张明、崔淑佳在本研究过程中给予的大力帮助。

参考文献
Bennett F.G.A., 1984, Resistance to powdery mildew in wheat: a review of its use in agriculture and breeding programs, Plant Pathol., 33(3): 279-300

Blanco A., Gadaleta A., Cenci A., Carluccio A.V., AbdelbackiA M.M., and Simeone R., 2008, Molecular mapping of the novel powdery mildew resistance gene Pm36 introgressed from Triticum turgidum var. dicoccoides in durum wheat, T- heor. Appl. Genet., 117(1): 135-142

Fu Y.B., Peterson G.W., Yu J.K., Gao L.F., Jia J.Z., and Richards K.W., 2006, Impact of plant breeding on genetic diversity of the Canadian hard red spring wheat germplasm as revealed by EST-derived SSR markers, Theor. Appl. Genet., 112(7): 1239-1247

Gao L.F., Tang J.F., Li H.W., and Jia J.Z., 2003, Analysis of microsatellites in major crops assessed by computational and experimental approaches, Mol. Breeding, 12(3): 245-261

Hao Y.F., 2008, Location of wheat powdery mildew resistance genes with molecular marker and marker-assisted selection, Dissertation for Ph.D., Shandong Agricultural University, Supervisor: Wang H.G., pp.69-70 (郝元峰, 2008, 小麦抗白粉病基因的分子标记定位及标记辅助选择, 博士学位论文, 山东农业大学, 导师: 王洪刚, pp.69-70)

Hsam S.L.K., Lapochkina I.F., and Zeller F.J., 2003, Chromosomal location of genes for resistance to powdery mildew in common wheat (Triticum aestium L. em. Thell.). 8. Gene Pm32 in a wheat-Aegilops speltoides translocation line, Eup- hytica, 133(3): 367-370

Huang H.Q., and Röder M.S., 2004, Molecular mapping of powdery mildew resistance genes in wheat: a review, Euphytica, 137(2): 203-223

J?覿rve K., Peusha H.O., Tsymbalova J., Tamm S., Devos K.M., and Enno T.M., 2000, Chromosomal location of a Triticum timopheevii derived powdery mildew resistance gene transferred to common wheat, Genome, 43(2): 377-381

Jia J., Devos K.M., Chao S., Miller T.E., Reader S.M., and Gale M.D., 1996, RFLP-based maps of the homoeologous group-6 chromosomes of wheat and their application in the tagging of Pm12, a powdery mildew resistance gene transferred from Aegilops speltoides to wheat, Theor. Appl. Genet., 92(5): 559-565

Li C.X., and Xu W.G., 2009, Researches and application on molecular markers of powdery mildew resistant genes in wheat, Zhongguo Nongxue Tongbao (Chinese Agricultural Science Bulletin), 25(10): 53-58 (李春鑫, 许为钢, 2009, 小麦白粉病抗病基因分子标记开发及应用研究进展, 中国农学通报, 25(10): 53-58)

Liu R.H., and Meng J.L., 2003, MapDraw: a microsoft excel macro for drawing genetic linkage maps based on given genetic linkage data, Yichuan (Hereditas (Beijing)), 25(3): 317- 321 (刘仁虎, 孟金陵, 2003, MapDraw, 在Excel中绘制遗传连锁图的宏, 遗传, 25(3): 317-321)

Ma H.Q., Kong Z.X., Fu B.S., Li N., Zhang L.X., Jia H.Y., and Ma Z.Q., 2011, Identification and mapping of a new powdery mildew resistance gene on chromosome 6D of common wheat, Theor. Appl. Genet., 123(7): 1099-1106

Miranda L.M., Murphy J.P., Marshall D., and Leath S., 2006, Pm34: a new powdery mildew resistance gene transferred from Aegilops tauschii Coss. to common wheat (Triticum aestivum L.), Theor. Appl. Genet., 113(8): 1497-1504

Miranda L.M., Murphy L.M., Marshall D., Cowger C., and Leath S., 2007, Chromosomal location of Pm35, a novel Aegilops tauschii derived powdery mildew resistance gene introgressed into common wheat (Triticum aestivum L.), Theor. Appl. Genet., 114(8): 1451-1456

Tosa Y., Tokunaga H., and Ogura H., 1988, Identification of a gene for resistance to wheatgrass powdery mildew fungus in common wheat cultivar Chinese Spring, Genome, 30(4): 612-614

Tosa Y., and Tada S., 1990, Operation of resistance genes in wheat to Erysiphe graminis f. sp. tritici against E. graminis f.sp. agropyri, Genome, 33(2): 231-234

Xie H., 2005, Molecular mapping of alien powdery mildew resistance genes in wheat (Triticum Aestivum L.), Dissertation for Ph.D., Zhongguo Agricultural University, Supervisor: Sun Q.X., and Liu Z.Y., pp.39-51 (谢皓, 2005, 小麦外源抗白粉病基因的分子标记, 博士学位论文, 中国农业大学, 导师: 孙其信, 刘志勇, pp.39-51)

Xu J.Q., He F., Cui F., Qi X.L., Yu L., Zhao C.H., and Wang H.G., 2012, Powdery mildew resistant locus in Tritileymus translocation line Shannong6343 mapped by molecular ma- rkers, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 10(1): 86-91 (徐金秋, 何方, 崔法, 亓晓蕾, 余利, 赵春华, 王洪刚, 2012, 小滨麦易位系山农6343抗白粉病基因的分子标记定位, 分子植物育种, 10(1): 86-91)

Xue F., Wang C.Y., Zhang L.H., Zhang H., Li H., Wang Y.J., Liu X.L., and Ji W.Q., 2012, Chromosome location and mo- lecular mapping of powdery mildew resistance gene PmAS846 originated from wild Emmer (Triticum turgidum var. dicoccoides), Zuowu Xuebao (Acta Agronomica Sinica), 38(4): 589-595 (薛飞, 王长有, 张丽华, 张宏, 李浩, 王亚娟, 刘新伦, 吉万全, 2012, 来自野生二粒小麦的抗白粉病基因PmAS846及其染色体定位和分子标记分析, 作物学报, 38(4): 589-595)

Yu J.K., Dake T.M., Singh S., Benscher D., Li W.L., Gill B., and Sorrells M.E., 2004, Development and mapping of EST-derived simple sequence repeat markers for hexaploid wheat, Genome, 47(5): 805-818

Zhan H.X., Chang Z.J., Yang Z.J., Zhang X.J., and Li X., 2010, Sources and evaluation of powdery mildew resistance genes in wheat, Zhongguo Nongxue Tongbao (Chinese Agricultural Science Bulletin), 26(10): 42-46 (詹海仙, 畅志坚, 杨足君, 张晓军, 李欣, 2010, 小麦抗白粉病基因来源及抗性评价的研究进展, 中国农学通报, 26(10): 42-46)