水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界超过一半的人口以其作为主要营养来源(Jiang et al., 2007)。20世纪80年代以前，中国面临人口基数大、环境污染及可利用耕地面积减少等问题导致粮食供给紧张的巨大压力，在稻作生产中过分强调产量的提高而忽视了品质的改善(程式华, 2000; 贾东等, 2009)。近年来，随着人民生活水平提高，特别是中国加入WTO后，国外优质稻米也随之涌入中国市场，可供消费者选择的大米愈加丰富，广大消费者对稻米品质要求也越来越高(朱昌兰等, 2004)。因此，不论是为了满足国内消费者对优质大米的需求还是应对国际市场的冲击，改良稻米的品质，尤其是改良籼稻品种的品质迫在眉睫。

稻米的品质主要包括蒸煮食味品质、理化品质和外观品质，其中直链淀粉含量(amylose content, AC)是衡量稻米蒸煮食味品的重要指标(Lou et al., 2009)。可根据AC把大米分为四种类型：糯米(0%~ 2%)，极低AC (3%~9%)，低AC (10%~19%)，中等AC (20%~24%)，高AC (＞24%) (Bergman et al., 2001)。低AC的大米，其糊化温度(gelatinization temperature, GT)往往较高，胶稠度(gel consistency, GC)相应较长，蒸煮后米饭黏而柔软，说明AC与稻米的蒸煮食味品质密切相关(Jin et al., 2010; Hossaina et al., 2009)。AC受第六条染色体上的蜡质基因(Waxy, Wx)控制，负责编码“结合在淀粉粒上的淀粉合成酶”(granule-bound starch synthase, GBSS) (Smith et al., 1997; 刘巧泉等, 2006)。研究显示，Wx基因第一个内含子供体+1位碱基G/T多态性位点影响该基因的表达，从而调控直链淀粉的合成。若突变位点为T碱基时，成熟mRNA表达量低，AC较低；而当为正常G碱基时，mRNA能够正常表达，AC较高(刘巧泉等, 2006)。随着对Wx基因遗传研究的深入， 发现Wx基因的微卫星多态性与AC高度相关(Ayres et al., 1997; Jayamani et al., 2007; Wan et al., 2007)。

稻谷粒型是水稻育种要选择的一个重要农艺性状，是决定产量和外观品质的一个重要因素(Lou et al., 2009; Wang et al., 2011)。粒型主要指粒长、粒宽及长宽比，根据长宽比可把粒型分为：粗短型＜2，2＜中间型＜3，细长型＞3。对于中国及大部分亚洲国家的消费者而言，细长的稻米更受欢迎(Fan et al., 2009)。目前，研究者趋向于认为粒型受多基因控制，并且发现了许多与粒型相关的QTL，如GS3 (Fan et al., 2006)是粒长的主效基因，GS5 (Li et al., 2011)和GW8 (Wang et al., 2012)参与控制粒宽。

随着分子生物学和遗传学的发展，标记辅助选择(marker assisted selection, MAS)孕育而生，其比传统的育种方法节省大量的人力和时间，具有高效且准确率高等优点，因此得到快速发展和大量运用。天B和龙特甫B是华南稻区生产上常用的两种保持系，AC含量较高，蒸煮食味品质差。因此，本研究以降低天B和龙特甫B的AC及改良龙特甫B的粒长为目标，通过MAS和回交育种方法相结合，使获得的改良系尽量保持亲本其它的优异农艺性状，为水稻育种提供中间材料。

1结果与分析
1.1分子标记辅助选择改良系
在水稻植株生长早期应用MAS对材料进行分析，预知供体亲本目的基因导入受体亲本的情况，有效地选择优良单株继续回交改良。软米对照亲本盟B和待改良亲本天B及龙特甫B的Wx基因分子标记结果表明，两者具有明显的多态性(图1; 图2)。因此，在选择过程中，通过MAS技术从回交后代中筛选出带供体亲本Wx基因的杂合单株，从自交后代筛选出纯合Wx基因单株。龙特甫B回交或杂交后代长粒单株的选择则是在Wx基因筛选后所得的群体中进行筛选，因为稻谷粒长为多基因控制，F₁群体中稻谷的粒长表现为中亲值，因此抽穗后即可通过田间观察筛选出杂合单株。回交及自交后代的选择除了Wx基因及长粒性状外，同时其它农艺性状尽量与待改善亲本保持相似。本研究一共获得了5个天B改良系(BC10292, BC10382, BC10462, BC10700和BC10702)和4个龙特甫B改良系(BC10670, 10672, BC11172和BC11174)。

图1 天B改良系的RM190分子标记检测结果 注: M: DL2000 marker; 1: 盟B; 2: 天B; 3~7: BC10292各改良单株; 8~12: BC10382各改良单株; 13~17: BC10462各改良单株; 18~22: BC10700各改良单株; 23~27: BC10702各改良单株 Figure 1 Determination of genotypes of RM190 molecular marker of Tian B improved lines Note: M: DL2000 marker; 1: Meng B; 2: Tian B; 3~7: Individuals in BC10292; 8~12: Individuals in BC10382; 13~17: Individuals in BC10462; 18~22: Individuals in BC10700; 23~27: Individuals in BC10702

图2 龙特甫B改良系的RM190分子标记检测结果 注: M: DL2000 marker; 1: 盟B; 2: 龙特甫B; 3~7: BC10670各改良单株; 8~12: BC10672各改良单株; 13~17: BC11172各改良单株; 18~22: BC11174各改良单株 Figure 2 Determination of genotypes of RM190 molecular marker of Longtepu B improved lines Note: M: DL2000 marker; 1: Meng B; 2: Longtepu B; 3~7: Individuals in BC10670; 8~12: Individuals in BC10672; 13~17: Individuals in BC11172; 18~22: Individuals in BC11174

1.2改良系稻米理化品质表现
于考种之前对改良系单株Wx基因多态性进行标记，图1和图2为其中5棵单株的标记结果。结果显示所选的单株在该位点都是纯合基因型，与参照亲本盟B的带型一致，确保了材料的准确性和纯度。待改良亲本天B的AC (23.5%)较高，通过与供体亲本回交2~3代，自交后获得纯合的改良株系。所筛选到的5个天B改良系的AC变化范围为11.4% (BC10700)到17.0% (BC10462)，AC极显著降低，这5个改良系的AC平均为14.4%，与盟B (14.8%)较接近(表1)。

表1 改良品系的稻米理化品质特性测定结果 Table 1 Rice chemical traits of improved lines

龙特甫B的AC比天B更高，为34.5%。筛选得到的4个龙特甫B改良系中，有两种株系，为BC10670与BC10672，BC11172与BC11174。前者通过杂交和二次回交后代中选择获得，后者仅通过一次杂交从后代选育获得。这两种龙特甫B改良系的AC较龙特甫B有极显著的降低，尤其是BC10670与BC10672降低更显著(表1)。

在GC和GT方面，所有相应的改良系的碱消值都较天B和龙特甫B减小，因此GT变高，而GC则变长(表1)。

1.3改良系稻米外观品质表现
单粒稻谷的粒长测定方法如图3所示，把10粒稻谷连成一条直线，测出总长，然后取平均值。待改良亲本天B谷粒长为9.95 mm，长宽比为3.34，大于3，属于细长型。所筛选得到的5个天B改良系的稻谷粒长较天B都有所增长，特别是BC10700增长到了10.30 mm；长宽比的范围则为3.65~3.94，较天B的3.34变化极显著(表2)。

图3 亲本和改良系的10粒稻谷长度 注: a: 天B; b: 龙特甫B; c: 盟B Figure 3 Length of ten grains in parents and improved lines Note: a: Tian B; b: Longtepu B; c: Meng B

 

表2 改良系外观品质分析结果 Table 2 Rice appearance qualities of improved lines

而龙特甫B为短粒型，粒长为8.10 mm，长宽比为2.36，大于2而小于3，属于中间型。通过回交转育，供体亲本的粒长基因导入龙特甫B，改善了龙特甫B的粒长。在所得的两种株系中，BC10670与BC10672平均谷粒长度约为10.40 mm，长宽比平均为3.80，粒长和长宽比均较龙特甫B有极显著差异；BC11172和BC11174平均谷粒长度为9.46mm，长宽比平均为3.64，粒长和长宽比均较BC10670和BC10672小，但与龙特甫B相比仍有极显著差异(表2)。

结果显示，天B和龙特甫B改良系的糙米率、精米率较待改良亲本降低明显或有所下降，但是天B改良系整精米率降低更明显，尤其是BC10700。龙特甫B改良系中的BC10670与BC10672的粒长及长宽比虽然增加了，但是整精米率却难有所改善，而BC11172与BC11174则是大幅降低。天B及龙特甫B改良系其垩白粒率及垩白度都有所降低或降幅较大(表2)。

1.3改良系农艺性状表现
天B及龙特甫B改良系的抽穗期与其相应的待改良系相似。株高方面除了BC10462、BC11172、BC- 11174比相应的亲本天B及龙特甫B矮之外，其余的改良系的株高均高于对应的待改良亲本。产量性状方面，天B改良系的单株有效穗数(除BC10292)、穗长及每穗总粒数(除BC10382)都大于天B，而千粒重则全小于天B，结实率则基本相差不大。龙特甫B改良系中BC10670与BC10672除了穗长大于龙特甫B，单株有效穗数、每穗实粒数、结实率与千粒重均低于龙特甫B；BC11172与BC11174则是除了单株有效穗数和穗长大于龙特甫B，每穗总粒数、结实率、千粒重方面则是相近或显著下降(表3)。

表3 亲本和改良系的主要农艺性状的表现 Table 3 Performance of main agronomic traits of parents and improved lines

2讨论
天B和龙特甫B是南方稻区水稻生产上常用的保持系，本研究通过对其米质进行改良，获得了AC和外观品质明显改善的改良品系，研究结果对于提高天B和龙特甫B组配的杂交水稻品质和延长优良保持系的使用受命具有重要的意义。

研究结果表明，通过分子标记辅助选择改良天B和龙特甫B的稻米品质是有效的。本文把AC较低的不同供体亲本Wx基因导入高AC的天B和龙特甫B这两个亲本，并辅以MAS技术，对改良其蒸煮食味品质取得了明显的效果。Jin等(2010)通过MAS技术把宜香B中的Wx-(CT)₁₇，SSⅡa (starch synthaseⅡa)，fgr (fragrance)三个控制不同品质的等位基因同时导入品质较差的Ⅱ32-B，改善了Ⅱ32-B的蒸煮食味品质。本研究充分体现出MAS技术加快了育种效率，龙特甫B改良系BC10670与BC10672之所以自交3次，就是为了验证筛选到的单株粒长是否有出现分离的情况，从而据此来判断所选单株粒长基因是否为纯合基因型。而Wx基因位点则可通过RM- 190分子标记得到快速确认，不需要经过多代自交加以确认，节省了大量时间。AC的改善是目前水稻育种改良很重要的一个方向，主要受Wx基因控制(朱昌兰等, 2004; 刘巧泉等, 2006; Lou et al., 2009; Jin et al., 2010)，Wx基因第一个内含子上的SNP (single nucleotide polymorphism)位点及微卫星多态性对AC的影响也有诸多的研究报道。Ayres等(1997)于89种非糯稻美国水稻核心种质中发现了7种(CT)n (分别为(CT)₈, (CT)₁₁, (CT)₁₄, (CT)₁₇, (CT)₁₈, (CT)₁₉和(CT)₂₀)，Jayamani等(2007)发现了9种(CT)_n (分别为(CT)₁₀, (CT)₁₁, (CT)₁₄, (CT)₁₅, (CT)₁₆, (CT)₁₇, (CT)₁₈, (CT)₁₉和(CT)₂₀)，Wan等(2007)发现了7种纯合(CT)_n (分别为(CT)₁₀, (CT)₁₁, (CT)14, (CT)₁₇, (CT)₁₈, (CT)₁₉和(CT)₂₀)及一个杂合型((CT)₁₁/(CT)₁₈)，并分析了SNP(G/T)和(CT)_n组合之间对AC的影响，且研究中Wx基因所用的SSR引物为根据其微卫星序列设计而成。本研究根据微卫星的多态性标记RM190来区分供体亲本及待改良亲本的Wx基因型(图1; 图2)，从而快速有效的筛选得到纯合的改良系单株，测定AC结果表明所获得的改良系AC都较待改良亲本下降明显。伴随着AC的降低，GC则延长，GT升高，稻米的理化品质得到全面的改善，这与刘巧泉等(2006)研究结果相似，Tian等(2009)等研究发现AC与GC、GT高度负相关。

研究者多认为粒长受多基因控制，属于数量性状遗传(江良荣等, 2003)，近年来发现主效基因GS3 (Mao et al., 2010)。Fan等(2009)根据GS3的第二外显子上的C/A突变设计了一对CAPS (cleaved ampliified polymorphic sequence)标记，并用设计的特异引物检测了180个品种，结果说明GS3与粒长呈高度相关。但是CAPS引物在大规模筛选育种上仍然具有一定的限制性，比如，所用到的特异限制性内切酶价格较昂贵。研究者以长粒与短粒品种杂交，发现F₁代植株的稻谷粒长介于双亲之间(石春海和申宗坦, 1995)，因此，可根据此在回交过程中通过田间选择获得杂合单株。所以本文改良龙特甫B先是用MAS对Wx基因进行筛选，然后在筛选得到的群体中通过田间观测，获得长粒杂合或纯合单株，这样大大提高了筛选效率，最终筛选出了4个龙特甫B改良系，不仅AC降低了，粒长也显著增加。

由于回交的代数少，导入待改良亲本的染色体片段可能较大，所以改良系的农艺性状与轮回亲本存在一定程度的差异。但是，这也丰富了育种材料，使育种选材过程中获得更多更丰富的选择。

3材料和方法
3.1亲本材料及田间试验方法
选用华南稻区生产上常用的籼稻品种天B和龙特甫B作为待改良亲本，供体亲本来源及系谱见表4。

表4 改良品系的受体、供体材料及其系谱 Table 4 Receptors, donors and pedigrees of the improved lines

采用杂交、回交方法转育优质性状，每次回交前都对所改良材料的Wx基因位点进行MAS (各材料回交代数见表4)，回交后代再经过自交，选育出纯合基因型的株系。龙特甫B回交及自交后代长粒型单株仅通过田间选育获得。亲本及选育出的株系于2012年统一种植于广西大学农场，每个材料15株，单行区，单本插，株行距15 cm×20 cm，肥水管理、防治病虫等同一般大田生产。实验中，选用盟B作为软米对照品系。

3.2分子标记检测
叶片总DNA的提取参照CTAB法(Murray and Thompson, 1980)。RM190作为Wx基因特异引物，其序列F：5'-CTTTGTCTATCTCAAGACAC-3'，R：5'-TTGCAGATGTTCTTCCTGATG-3' (Wan et al., 2007)。PCR检测采用10 μL反应体系：模板1 μL (50 ng/μL)，引物1 μL (10 mol/L)，10×PCR Buffer 1 μL，dNTP 1 μL (2  mmol/L)，Taq DNA聚合酶0.1 μL (5 U/μL)，然后用双蒸水补足10 μL。PCR扩增程序为：95℃ 5 min；95℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，30个循环；72℃ 10 min (Myint et al., 2009)。用7%聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测(Bassam et al., 1991)。

3.3重要农艺性状考察及品质性状分析
考察亲本和改良品系的重要农艺性状主要包括抽穗期、株高、单株有效穗数、穗长、每穗总粒数、每穗实粒数、结实率、千粒重；分析的外观及研磨品质参数包括粒长、粒宽、长宽比、糙米率、精米率、整精米率、垩白率、垩白大小和垩白度。其中抽穗期、株高、穗长和有效穗数在试验田进行记录，其它的性状于稻谷成熟后收种置于实验室自然干燥至少1个月，待米质稳定后再测定获得数据。所得的数据均使用SPSS软件处理分析。

3.4稻米品质测定
根据农业部颁布NY147-88标准测定AC、GC和GT。以标准品种为对照获得标准曲线，然后通过标准曲线计算出试样的AC含量。GC为米胶流淌的长度(试管底部到胶流动到的位置)，胶长则稻米往往较软，短则较硬。GT通过间接测定碱消值来评估，碱消值高意味着较低的GT，低的碱消值意味着较高的GT。

作者贡献
胡德辉是本研的实验设计和实验研究的执行人；胡德辉及周萍完成数据分析，论文初稿的写作；刘开雨参与实验材料的群体构建以及田间材料的种植管理；刘芳，韦政，黎志方，邱永福参与实验设计和实验结果分析；李容柏是项目的构思者和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由广西科学技术与开发项目(桂科攻1123001-3B)和广西大学科研基金项目(XDZ11008)共同资助。感谢实验室郑加兴、覃嘉明、刘立龙和桑洪玉等在实验过程中给予的指导和帮助。

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