红掌(Anthurium andraeanum)是世界重要的热带花卉，为天南星科植物，明艳华丽的佛焰苞是其变态叶，也是主要的观赏部位。目前国内外对红掌的研究主要集中在红掌的组织培养、栽培、杂交育种和病虫害防治等方面，有关佛焰苞颜色调控机制的研究报道较为鲜见。

花青素是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属于类黄酮物质(侯夫云等, 2009)，以苯丙氨酸为前体经一系列的酶促反应合成，经不同的羟基化、糖基化、甲基化、酰基化修饰后被转运到液泡中予以汇集(Holton and Cornish, 1995; Mol et al., 1998)，自然状态下常与各种单糖形成花色苷，吸光后表现出红、蓝、紫等各种色彩。原花青素，又称缩合单宁，是苯丙醇代谢途径产生的次生代谢产物(Deluc et al., 2006)，一般无色。花青素还原酶(ANR)则是合成原花青素的关键酶，花青素通过ANR催化生成原花青素，而不通过尿苷二磷酸-葡萄糖-类黄酮-3-葡糖基转移酶(UFGT)转化为稳定的花青苷(Xie et al., 2003; 2004; Bogs et al., 2007)。因此，可以说ANR基因在花青素合成途径中具有负调控作用(马敬等, 2012)。不同途径竞争同一底物是花青素途径调控机制之一，拟南芥缺少ANR能增加花青素的合成(Albert et al., 1997)。

本研究从红掌中克隆了ANR基因，并对其进行表达分析，旨在深入了解红掌ANR对花青素代谢途径的调控作用和与佛焰苞颜色的关系，为通过基因工程改良红掌佛焰苞颜色奠定一定基础。

1结果与分析
1.1红掌ANR基因的克隆及序列分析
用CTAB法提取红掌阿拉巴马幼嫩佛焰苞的RNA，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度为108.2 ng/μL，OD260/280值为1.90；琼脂糖凝胶电泳检测结果显示所提取的RNA有28S、18S两条主带(图1)，说明此RNA完全能够满足RACE反转录的需要。

图1 阿拉巴马佛焰苞RNA琼脂糖凝胶电泳图 Figure 1 Agrose gel electrophoresis of RNA of A.‘Alabama’ spathe

用ANR保守区片段设计RACE巢式PCR引物，通过5’和3’RACE分别获得5’RACE和3’RACE特异性条带(图2)，将条带分别连接到pMD?誖18-T Vector载体上，转入DH5α，进行重组质粒鉴定，测序拼接得到1 237 bp cDNA全长序列。根据该基因开放阅读框设计引物AnANR-F和AnANR-R，以反转录的cDNA为模板扩增全长(图3)，测序拼接后得到1 237 bp cDNA全长序列，与拼接片段一致。

图2 红掌ANR基因3’RACE和5’RACE产物的琼脂糖凝胶电泳结果。 注: M: DL2000 marker; 1: 5’RACE; 2: 3’RACE Figure 2 Agrose gel electrophresis of 3’RACE and 5’RACE PCR products of AnANR gene. Note: M: DL2000 marker; 1: 5’RACE; 2: 3’RACE

图3 红掌ANR全长序列扩增 注: M: DL2000 marker; 1: AnANR-F和AnANR-R扩增; 2: 酶切鉴定 Figure 3 RT-PCR amplification of ANR cDNA full-length from anthurium Note: M: DL2000 marker; 1: Amplification products of AnANR gene; 2: Identification of recombinant plasmid of AnANR gene

1.2生物信息学分析
红掌ANR基因全长核苷酸序列共1 237 bp，BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/)结果显示，目的基因与GenBank中注册的其它道植物的ANR基因具有72%~75%的同源性(表1)。该序列共编码413个氨基酸序列，与葡萄、茶树和毛杨果等植物有73%~75%的同源性(图4)，因此确定其为红掌ANR基因，并命名为AnANR。

表1 红掌ANR基因和其它植物ANR基因核苷酸序列同源性比较 Table 1 Similarities of AnANR gene and ANR genes of other plants in nucleotide sequence

图4 红掌, 毛杨果, 茶树和葡萄的ANR氨基酸序列同源性比较 Figure 4 Multiple sequence alignment for the amino acid sequences of ANR with Anthurium, Populus trichocarpa, Camellia sinensis and Vitis vinifera

1.3红掌ANR基因在不同颜色红掌中的表达分析
本研究提取了红掌8个不同颜色佛焰苞的花青素，其测定结果表明，在‘阿拉巴马’、‘亚利桑那’和‘热情’这3个红色系中，前二者佛焰苞的花青素含量是最高的，‘热情’稍次之；在‘情迷’和‘粉冠军’这两个粉色系中，前者的佛焰苞花青素的含量稍高于后者；在‘阿拉巴马’白色佛焰苞突变体，‘白冠军’和‘白雪公主’这3个白色系中，前二者检测到较低含量的花青素，而‘白雪公主’中花青素的含量几乎为零(图5B)，这与实验观察到的外部特征相符。

图5 红掌不同品种佛焰苞花青素含量及ANR基因的表达差异 注: A: 不同品种佛焰苞; B: 不同品种中花青素的含量; C: 不同品种中ANR的表达量; a: 阿拉巴马; b: 亚利桑那; c: 热情; d: 情迷; e: 粉冠军; f: 突变体; g: 白冠军; h: 白雪公主 Figure 5 Anthocyanidin cotents and expression levels of AnANR in different anthurium spathes Note: A: Spathes of different anthurium variaties; B: Anthocyanidin cotents in different anthurium variaties; C: Expressing levels of ANR in different anthurium variaties; a: Alabama; b: Arizona; c: Tropical; d: Sharade; e: Pink champion; f: Alabama mutate; g: White champion; h: Snow white

红掌ANR在这8个品种中的半定量结果显示，在红色系的佛焰苞中，ANR的表达量是最弱的，其中‘阿拉巴马’与‘亚利桑那’表达量一致，‘热情’比前二者稍强；在粉色系中，ANR表达量比红色系强，其中‘情迷’稍弱于‘粉冠军’；白色系中，ANR在‘阿拉巴马’白色佛焰苞突变体及‘白冠军’均有很强的表达量，而在‘白雪公主’中则不表达(图5C)。

从红掌花青素含量测定及ANR半定量结果中可以看出，在具有花青素的品种中，随着花青素含量的提高，ANR的表达量减弱；但在花青素含量为零的品种中，ANR基因不表达。

2讨论
ANR反应的主要产物为黄烷-3-醇(Xie et al., 2003)，而黄烷-3-醇不仅是原花青素的主要组成成分，更是原花青素聚合反应的起始单位(Paolocci et al., 2007)。ANR利用NADPH，将原花色素转变成黄烷-3-α-醇，黄烷-3-α-醇与花色素苷拥有同一个合成前体即花色素原(Han et al., 2012)，因此黄烷-3-α-醇与花色素苷合成时要竞争同一个底物，ANR使花青素直接生成原花青素。因此，在花青素和原花青素之间的转化途径中ANR扮演着很重要的角色。

花青素含量的测定结果显示，颜色深的佛焰苞花青素含量则高，颜色浅的则含量低，纯白色的佛焰苞中则几乎检测不到花青素。随着佛焰苞颜色的变浅，AnANR的表达则加强，而AnANR在检测不到花青素的品种中不表达。因而推测，在没有花青素的红掌中，AnANR可能在花青素途径中起不到限速酶的作用而沉默；在红色系的3个品种中，由于AnANR表达量低，间接的促进了作用底物向花青素途径的转化，使花青素得以积累；而在白色系的‘阿拉巴马’突变体和‘白冠军’中，AnANR的表达量相对高，促进原花青素合成，合成的花青素相对较少。尤其是在红掌‘阿拉巴马’白色突变体中，AnANR很可能扮演着均衡红掌原花青素含量这一重要角色，AnANR在调节花青素和原花青素的这一关键步骤中失衡，因此破坏了二者间的平衡使得佛焰苞颜色突变，但AnANR是否起了决定性的作用并如何起作用尚需进一步研究。

3材料与方法
3.1材料
本研究采用3个色系(红色, 粉色, 白色)，8个不同品种的红掌为植物材料(表2)，均由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所植物离体繁殖与保存中心提供。取其同一时期未展开的佛焰苞，进行外部形态观察(表2)，之后洗净，液氮速冻，-80℃保存。RACE试剂盒购自Clontech公司，PCR所用试剂、反转录试剂盒、pMD^®18-T Vector、限制性内切酶购自Promega公司。

表2 不同品种佛焰苞颜色 Table 2 Colors of different Anthurium cultivars

3.2方法
3.2.1 RNA提取
所有植物材料的RNA均用CTAB法(王玉成等, 2006) 提取，再用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测其纯度和浓度。

3.2.2红掌ANR基因5’RACE第一链cDNA的合成
取3 μL RNA样品，1 μL 5’ CDS Primer A，1 μL SMARTⅡA oligo于离心管中，混匀微离心；70℃，2 min；冰上冷却2 min后，加入1 μL 10×Buffer，2 μL DTT (10 mmol/L)，4 μL dNTP Mix (2.5 mmol/L)，0.5 μL反转录酶，混匀，42℃，1.5 h；再加入20 μL的EDTA Buffer终止反应；72℃，7 min，-20℃保存备用。

3.2.3红掌ANR基因3’RACE第一链cDNA的合成
取3 μL RNA样品，1 μL 3’ CDS Primer A于离心管中，混匀微离心；70℃，2 min；冰上冷却2 min后，加入1 μL 10×Buffer，2 μL DTT (10 mmol/L)，4 μL dNTP Mix (2.5 mmol/L)，0.5 μL反转录酶，混匀，42℃，1.5 h；再加入20 μL的EDTA Buffer终止反应；72℃，7 min，-20℃保存备用。

3.2.4红掌ANR基因5’RACE PCR扩增
以合成的5’RACE第一链cDNA为模板，以5’GSP1 (5’-CTCCATCACCAGCCCCGTC-3’)和通用引物UPM (试剂盒自带)为引物进行第一轮PCR；再以第一轮PCR产物稀释50倍为模板，以5’GSP2 (5’-TCACCCGCTTCACCGTCG-3’)和NUP (试剂盒自带)为引物进行第二轮巢式PCR扩增，扩增条件参照RACE试剂盒说明书。

3.2.5红掌ANR基因3’RACE PCR扩增
以合成的3’RACE第一链cDNA为模板，以3’GSP1 (5’-TTTGCCAAGACGATGACAGAGA-3’)和通用引物(UPM)为引物进行第一轮PCR，再以第一轮PCR产物稀释50倍为模板，以3’GSP2 (5’-TAACTCCAGACCCCCCTTTCA-3’)和NUP为引物进行第二轮巢式PCR扩增，扩增条件参照RACE试剂盒说明书。

3.2.6 PCR产物的克隆与重组质粒鉴定
将5’和3’RACE PCR产物分别与pMD^®18-T Vector连接；取5 μL连接产物加入到50 μL DH5α冰浴30 min后，42℃水浴60 s，冰上放置2 min，加入950 μL液体LB培养基，37℃，200 rpm培养1 h；取50 μL菌液接种在含有IPTG和X-gal的LB Amp+固体培养基上，倒置平板于37℃培养8~12 h。挑选白色菌落加入到含Amp 100 mg/L的3~5 mL LB液体培养基中，37℃，200 rpm培养8 h左右，取1 μL菌液为模板进行PCR鉴定，挑选阳性克隆的菌液进行测序。测序后将获得的5’和3’cDNA序列进行拼接，设计5’和3’引物进行PCR得到目的基因全长。

3.2.7花青素含量的测定
每个样品取嫩佛焰苞100 mg，在液氮中研磨，装入10 mL离心管中，快速加入5 mL甲醇(含0.1%盐酸)，震荡5次，每次20 s，使之混匀，静置1 min后涡旋，4℃下，12 000 g离心10 min，取300 μL上清液，加入200 μL超纯水和500 μL氯仿，涡旋1 min，4℃下，12 000 g离心2 min，取上清液，用等体积的甲醇(含0.1%盐酸)稀释，用紫外分光光度计测其在530 nm处和657 nm处的值。花青素的含量用下列公式计算：Q=10×A530-2.5×A657 (mg·g^-1·FW)。

3.2.8红掌ANR基因表达特性分析
根据扩增获得的全长cDNA序列设计特异引物ANR-S (5’-GGTGAAGCGGGTGATCTTG-3’)和AN- R-AS (5’-TTCTCTGTCATCGTCTTGGCA-3’)，选取β-actin为内参基因(actin-s: 5’-GGTGGAGCCACGACCTTA-3’; actin-as: 5’-CTCTCATTGGGATGGAAGC-3’)。取8个不同品种的佛焰苞，分别提取RNA反转录成cDNA，用内参调整8个不同品种的反转录模板浓度，使β-actin的表达量一致后进行RT-PCR。RT-PCR反应体系：2.5 μL 10×Buffer、2 μL dNTP Mix (2.5 mmol/L)、0.2 μL Taq酶、引物各加0.5 μL、模板用量根据调整的结果加入，无菌水补齐至25 μL体系。PCR反应程序：94℃ 5 min；94℃ 45 s，58.6℃ 45 s，72℃ 1 min，28个循环；72℃ 10 min。

作者贡献
李雪是本研究试验的执行人，完成实验结果分析、数据分析和论文写作；丛汉卿参与实验设计和结果分析；李志英和徐立是项目的构思者和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由海南省自然科学基金(313069)和中央级公益性科研院所基本科研业务费(PZS015)共同资助。感谢中国热带农业科学院热带作物品中资源研究所、农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室和海南省热带作物种质资源遗传改良与创新重点实验室提供试验条件。

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