谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase, GSTs)广泛存在于植物体中，是一个二聚体蛋白酶的超家族，主要起催化三肽的还原型谷胱甘肽和各种亲电化合物的亲电取代反应的作用(Armstrong et al., 1997)，然后通过选择性ABC转运蛋白将结合有谷胱甘肽的产物运输到液泡内，达到植物体内的去毒效果(伍忠銮等, 2004)。多种外界信号可诱导刺激GSTs的合成，如氧化胁迫、机械损伤、高温、除草剂等外界逆境(Flury et al., 1995)。同时植物体内GSTs的合成还能受细胞分裂素、生长素、乙烯等植物激素的影响(廖祥儒等, 1996, 生命的化学, 16(6): 22-24; Marrs, 1996)。GSTs主要具有三方面的功能：(1) 催化各种谷胱甘肽(GSH)依赖的生物转化反应；(2)催化类似于异源产物的自然产物的结合反应；(3)在细胞间结合和运输植物化合物(Edwards et al., 2000)。

乙烯(ethylene)是植物组织或细胞中合成的一种重要的植物激素，分子结构为H2C=CH2，因其能够微溶于水，故可通过溶解于水或气体扩散形式在植物体内运输。乙烯广泛参与了调控植物的生长和发育过程，如：根叶茎花的发育、种子的萌发、偏上生长、器官衰老与脱落、果实成熟以及对环境胁迫的反应等。实验发现，受乙烯调控的启动元件广泛存在于伤害诱导的防御反应蛋白以及能促进器官衰老和脱落、调控果实后熟的多种酶的基因上(Bleecker and Kende, 2000)。阿蒂擎天(Attila)属凤梨科(Bromeliaceae)果子蔓属(Guzmania)植物，是常见的观赏凤梨，因生长缓慢，营养生长期长，为适应市场需求，利用乙烯及其衍生物进行人工诱导开花，已经成为凤梨科植物栽培中普遍采用的方法(Bernier et al., 1993)。实验证明使用乙烯利对凤梨科植物进行灌心处理，能够使其提前开花，花期也呈现一致性(梁东成和黄万和, 2005)。

在前期工作中，本研究曾以阿蒂擎天凤梨乙烯处理后植株和未处理的植株为实验组和对照，构建了抑制差减杂交(SSH)文库(信彩云等, 2010)。在本实验中，从文库中筛选到了一个编号为A263长度为264 bp的GST基因片段，旨在对其进行克隆和分析乙烯处理后的表达变化，并初步探索乙烯信号与谷胱甘肽-S-转移酶表达变化之间的关系，为更深入地研究GST如何在凤梨植物开花过程中发挥作用奠定了基础。

1结果与分析
1.1谷胱甘肽-S-转移酶基因的获取
本研究提取的乙烯处理后0、1 h、6 h和24 h的样品总RNA，经核酸蛋白仪检测，其A260/280在1.8~2.0之间；用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测显示总RNA的完整性较好(图1)，能够满足后续试验的需要。

图1 对照和不同处理时间总RNA电泳结果 Figure 1 Electrophoresis of total RNAs extracted from the control and the different time treated materials

以SSH文库筛选的序列A263为基础，通过RACE延伸在400 bp处获得与5’端片段预测大小相符的条带(图2A)，500 bp处获得与3’端片段预测大小相符的条带(图2B)，回收产物后连接转化测序。经序列拼接，得到长度为945 bp的序列。

图2 谷胱甘肽-S-转移酶基因(A263)克隆 Figure 2 Agarose gel electrophoresis of GST (A263) RACE

1.2谷胱甘肽-S-转移酶基因序列分析
通过RACE结果拼接获得基因全长为945 bp，编码215个氨基酸，分别通过NCBI的BLASTn和BLASTp同源性比对，分析表明该序列与其它物种的谷胱甘肽-S-转移酶基因有较高的同源性，因此推断该cDNA序列为编码阿蒂擎天谷胱甘肽-S-转移酶的全长cDNA序列。其氨基酸序列与玉米、小麦的谷胱甘肽-S-转移酶的同源性比对如图3。用ProtParam预测其蛋白分子量是24134.8 Da，理论等电点PI为6.08。亲水/疏水性分析显示此蛋白可能存在三个疏水区，三维结构预测显示此蛋白有一个用红色标示的活性部位(图4)。同时亚细胞定位显示，此GST最有可能存在于细胞质中。

图3 GST(A263)与玉米和小麦GST基因氨基酸编码同源性比较 Figure 3 The comparison of A263 with the GST amino acid sequences among rice, corn and wheat

图4 谷胱甘肽-S-转移酶的三维结构 Figure 4 3D structure of GST

1.3乙烯诱导谷胱甘肽-S-转移酶表达水平变化
半定量RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测显示出表达水平的变化(图5A)。为更直观反映表达差异，本研究利用ImageJ软件结合电泳条带面积，算出其平均灰度值，并最终转化为总光密度(OD)；使用内参Actin总光密度值对GST的相关数值进行归一和量化，结果表明谷胱甘肽-S-转移酶基因在0 h的材料中略低，而在1h的处理材料中升高，然后逐渐降低(图5B)。

图5 GST(谷胱甘肽-S-转移酶)半定量PCR检测结果(A), GST的光密度比值结果(B) Figure 5 The result of GST semi-quantity RT-PCR (A) and Ratio of light density of GST (B)

2讨论
张鲲等(2011)证实在乙烯利处理蜻蜓凤梨1 h后，AfMKK1基因表达量就开始出现升高，然后持续处于高表达水平。本实验中，GST表达量1 h后即开始增加，印证了凤梨如同其它多种植物一样，乙烯可刺激其GST的生成，同时从侧面说明了乙烯信号的传递的速度是十分迅速的。

植物中GSTs的表达可受多种逆境胁迫相关激素的影响，如脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)等(Zhou and Goldsbrough, 1993; Dixon et al., 1998; Wagner et al., 2002; Tsuchiya et al., 2004)。植物在受到这类激素处理后会加强细胞内活性氧物质(ROS)的产生和积累。乙烯作为一种植物激素，能够引起植物对环境胁迫的反应，可受乙烯信号调控的启动元件存在于多种可受伤害诱导的防御反应蛋白基因上(Bleecker and Kende, 2000)。根据“诱导愈伤反应的假说”：一般植物在遇到不良环境或受到伤害时，便会增加体内乙烯，这种乙烯被称为创伤乙烯或应激诱导乙烯，它作为动员贮备物质的化学信号向周围组织传递，引起愈伤反应。本实验中筛选到的编码谷胱甘肽-S-转移酶，其功能可能是解除外源底物的毒性所必需的(Mueller et al., 2000)。

GSTs家族成员除了具有催化活性外，还可以作为转运蛋白使用(Sheehan et al., 2001)，已经有实验揭示拟南芥中GSTs成员At5g17200 (AtGSTF12; 或称TRANSPARENT TESTA19)是向液泡中转运花青素所需要的，谷胱甘肽-S-交联结合泵式结合ATP的运输转运器，通过输水基间的交互作用结合花青素苷，然后运送到液泡膜上(Kitamura et al., 2004; Grotewold, 2004)。此外欧芹细胞培养物的研究数据表明，谷胱甘肽-S-转移酶基因在UV诱导花青素合成关键基因CHS表达的早期信号传导中是必需的(Loyall et al., 2000)。在观赏凤梨在栽培中发现植株在开花前叶杯基部有变红的迹象，说明乙烯在诱导凤梨开花的可能同时促进花青素的合成，而且在SSH文库中筛选到谷胱甘肽-S-转移酶基因，有可能参与了这些花青素的合成。另有研究发现，一种GSTs基因At1g78730 (AtGSTU20)能够与光受体Far-Red Insensitive219 (FIN219)发生互作，从而对光信号产生响应并在细胞延长和植株发育过程起到重要的信号传导作用(Chen et al., 2007)。

综上所述，可推测凤梨用乙烯利灌心处理后，外源乙烯进入凤梨体内，生成大量的内源乙烯，产生人为诱导的愈伤反应，随后，GST作为多种植物体内的主要解毒系统，同时诱导了具有抗氧化作用的花青素的生成，共同参加了植物体的这种抗逆反应机制。当然其详细过程，还需要进一步的深入探索。

本实验所获得的阿蒂擎天凤梨的GST基因，经生物信息学分析，可以认定为在凤梨科植物中新克隆到的一个谷胱甘肽-S-转移酶家族成员，并明显受乙烯信号影响。但其在乙烯处理后凤梨植株的一系列反应变化中具体发挥什么作用还不清楚。GSTs类基因在多种模式植物上研究得已经比较深入，但在热带花卉中，几乎无人涉足，在观赏凤梨中对GSTs基因的深入研究，对提高热带花卉的抗逆和品质具有重要价值，而且其功能在热带植物与多数模式植物是否有不同之处，也值得进一步探索。

3材料与方法
3.1材料
阿蒂擎天凤梨(Guzmania wittmackii ‘Attila’)，来自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所的实验基地大棚。挑选生长良好、发育成熟、大小一致的植株(具有20片叶龄以上)，用400 ppm的乙烯利10 mL对植株叶心位置进行灌心处理；实验对照采用以清水灌心植株。本研究剥取对照植株和乙烯利分别处理1 h、6 h、24 h后的植株心叶(分别命名为0 , 1 h, 6 h, 24 h)，液氮冷冻后-80℃保存。

3.2总RNA的提取及cDNA第一链的合成
总RNA的提取使用CTAB法，使用DNaseⅠ (Takara)去除RNA中残留DNA，cDNA第一链合成使用SuperScriptTM Ⅲ Reverse Transcriptase (Invitrogen)，步骤按说明书操作。

3.3 5’RACE和3’RACE
以总RNA为材料，利用SMARTTM PCR cDNA Amplification Kit (Clontech) 合成5’RACE和3’RACE的模板，按试剂盒操作说明书扩增基因的5’和3’端序列。PCR扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，特异扩增条带经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Tiangen)回收纯化后克隆到PMD-18T克隆载体(Takara)上，进行测序。用Primer premier 5.0软件设计GST基因5’RACE和3’RACE的各两对巢式引物如下：

3’RACE外侧引物：5’-GTAGCCTCAAGGAGTCGGCGATGGT-3’；3’RACE内侧引物：5’-TACAACCCTGTGGTCTCCCCCATCATCT-3’；5’RACE外侧引物：5’-CTGGTCACAGACACCCCCGAAGAAC-3’；5’RACE内侧引物：5’-ATCGCCGACTCCTTGAGGCTACTATC-3’。

3.4基因序列分析
使用ORF Finder在线工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)预测此基因的阅读框架，使用BLAST工具对预测的氨基酸序列进行比对分析，用DNAMAN软件进行氨基酸序列拼接及比对，用PortParam (http://www.expasy.org/tools/protparam.html)预测其蛋白分子量和等电点，用PortScale Sever在线工具(http://www.expasy.org/tools/protscale.html)进行疏水性/亲水性预测，用WoLF PSORT在线工具(http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/)进行亚细胞定位预测，用SWISS-MODEL在线工具(http://swissmodel.expasy.org/)进行三维预测，三维模型的查看软件为RASTOP 1.3.1。

3.5半定量RT-PCR
利用半定量RT-PCR检测部分基因在植株中的表达情况，以对照和不同处理阶段为材料，所有的RT-PCR反应均来自同一批反转录的cDNA产物且重复3次，actin为内参，PCR扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。所用GST基因及actin的引物为Primer premier 5.0软件设计，序列如下：GST正向引物：5’-CGACCTTCTGGTCACAGACA-3’；GST反向引物：5’-AAGCACAAGTCGGACCTCTT-3’；actin正向引物：5’-CATGAAGATCAAGGTCGTCG-3’；actin反向引物：5’-ACTTCCGGTGAACAATGGAC-3’。

作者贡献
丛汉卿和信彩云是本研究的实验设计和实验研究的执行人；丛汉卿完成数据分析，论文初稿的写作；徐立负责本研究的实验设计；张银东和李志英参与实验设计；李志英是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由海南省自然科学基金(808191)及博士启动基金(PZSb0806, PZSb0604)共同资助。

参考文献
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