小麦的多属杂种是指把三个或三个以上种、属的染色体组、染色体或染色体片段结合在一起，产生具有多属特点的杂种。多属杂种的创制也为在同一遗传背景下研究不同种、属间染色体(组)的关系提供了有利条件(李集临等, 2011)。多年来，人们利用小麦的近缘种、属进行小麦的遗传改良，已逐渐由利用单一的近缘种、属，向综合利用多种近缘种、属发展(张红军等, 2000)，将不同近缘种的优良基因转移到小麦中，以适应人们对现代小麦育种目标的要求，从而获得具有多种、属特点的杂交种，这对小麦的品种改良有重要意义。

研究表明，在小麦多属杂交的育种中，已经获得小麦-黑麦-偃麦草三属杂种的材料，如Vos (1983)用中国春与长穂偃麦草杂交合成的双二倍体再与二倍体黑麦杂交，获得三属杂种。俞春江等(1994)用法国六倍体小黑麦与中3杂交，蓉珊(1979)、白瑞珍等用小偃麦和小黑麦杂交(白瑞珍等, 1985, 黑龙江农业科学, (1): 50-53)，齐津H.B.等利用他创制的多年生小麦和多年生黑麦杂交(齐津H.B.等, 1992, 农业出版社, pp.277-294)，Ferrari等(2005)用六倍体小黑麦和八倍体小偃麦杂交等，均获得三属杂种，但多未作杂种的分子检测。

本研究对八倍体小偃麦“麦草8号”和六倍体小黑麦“哈师209”杂交F₃代90个植株进行特异分子标记和细胞学检测，结果表明这些材料具有小麦-偃麦草-黑麦三属染色体组遗传成分，植株表现为抗病、大穗、多花多粒等特点，为创制具有三属杂种的新遗传资源提供了理论与应用基础。

1结果与分析
1.1 R、E和St染色体组特异分子标记检测
利用R、E和St染色体组特异分子标记，对杂种F₃代的90个植株及对照组进行分子标记分析鉴定。结果表明，利用R组特异引物PSC119.1进行扩增，对照冬黑麦、哈师209和F₃植株扩增出750 bp片段，八倍体小偃麦和中国春没有扩增(图1)；利用E组特异引物P3、P4进行扩增，对照二倍体、四倍体长穂偃麦草和F₃植株扩增出约为982 bp片段，中国春没有扩增(图2)；利用St组特异引物St542进行扩增，对照中间偃麦草和F3植株扩增出750 bp和450 bp片段，二倍体长穗偃麦草和中国春没有扩增(图3)。以上结果说明，F₃代90个植株均具有R、E和St染色体组成分。

图1 R组的特异引物PSC119.1扩增结果 注: M: DL2000 marker; 1: 冬黑麦; 2: 哈师209; 3: 八倍体小偃麦; 4: 中国春; 5: 3-11; 6: 3-34; 7: 4-42; 8: 11-27; 9: H-20; 10: 11-12; 11: H-25; 12: 3-21; 13: 11-6; 14: H-33 Figure 1 The amplified banding pattern generated by using specific primer PSC119.1 in R group Note: M: DL2000 marker; 1: Whinter rye; 2: Hashi209; 3: Trititrigia (8X); 4: Chinese spring; 5: 3-11; 6: 3-34; 7: 4-42; 8: 11-27; 9: H-20; 10: 11-12; 11: H-25; 12: 3-21; 13: 11-6; 14: H-33

图2 E组特异引物P3, P4扩增结果 Figure 2 The amplified banding pattern generated by using specific primer P3 and P4 in E group

图3 St组特异引物St542扩增结果 Figure 3 The amplified banding pattern generated by using specific primer St542 in St group

1.2八倍体小偃麦和六倍体小黑麦杂交F3代植株的形态学观察
F₃代植株表现为高大繁茂，其中43株有芒，49株紫茎，81.5%具有再生能力，40%具有抗病性，分蘖数在4~40之间，籽粒饱满度优于六倍体小黑麦哈师209 (图4)。株高在75 cm~157 cm之间，穂长在8 cm~31 cm之间，小穗数最多达35个，结实率85%。其中14-22、3-29和H-25等22个植株表现出小偃麦性状，如植株较高、生长旺盛、晚熟、多花和抗三锈等性状；3-47、14-6和H-22等16个植株表现出小黑麦性状，如大穂、小穗排列稀疏、穂颈有茸毛和抗白粉病等。

图4 哈师209 (上)和F3代籽粒(下)形态比较 Figure 4 Morphological comparison on hashi209 (up) and the seed of F3 (down)

1.3八倍体小偃麦和六倍体小黑麦杂交F₃代植株的细胞学分析
对F3植株的花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ和根尖细胞染色体数目进行检测，结果表明花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ，二价体数14-21，单价体数2-9 (图5)；根尖细胞染色体数在48~54之间(图6)。

图5 植株3-21减数分裂中期Ⅰ Figure 5 Meiosis metaphase I of 3-21

图6 植株3-3的根尖细胞染色体 Figure 7 Chromosome in root tip cell of 3-3

2讨论
本研究对八倍体小偃麦麦草8号与六倍体小黑麦哈师209杂交的F₃代90份材料进行形态学、分子细胞遗传学检测，结果表明：F₁根尖染色体为49条，F₃的分子细胞遗传学检测分别扩增出R组、E组和St组染色体片段(St染色体片段可能来自中间偃麦草E₁E₂St)确定是真实杂种后代。F₂、F₃育性逐步提高，根尖染色体数变动在42~56间，多为49以上(图6)，花粉母细胞二价体数变动在14~28间，多为18以上(图5)，可能D染色体与E组染色体亲缘关系较近，发生配对，出现大量的棒状二价体，染色体有向多数发展的趋势。因此F3得到一些生长繁茂、大穗、多小穗(30多个)、多花、多分蘖(30个)、籽粒饱满度较好(图5)、抗病、耐旱、抗寒、有再生能力的材料。说明F₃代仍具有R组、E组和St组染色体，如果能按上述优良性状继续选择，有可能获得A、B、D、E和R多组染色体或染色体片段稳定的杂种。如果是八倍体可能为AABBDDER,E、R染色体组可能组成新染色体组，或者恢复为AABBDDEE，R组染色体以易位的形式分散在其它染色体组中。这些具优良性状的株系，对多属杂交具有重要的研究意义和利用价值。

3材料与方法
3.1杂交组合配制及杂种后代选育
八倍体小偃麦“麦草8号”(T. trititrigia, AABBDDEE, 2N=56)和六倍体小黑麦“哈师209”(T. triticale, AABBRR, 2N=42)杂交F₃代90份植株材料、对照中国春(Chinese spring)均由哈尔滨师范大学遗传学教研室提供。二倍体长穗偃麦草(Th. elongatum, 2n=2x=14, E^eE^e)，四倍体长穗偃麦草(Th.elongatum 4x, 2n=28, E₁E₁E₂E₂)和中间偃麦草(Th. Intermedium, E₁E₁E₂E₂StSt, 2n=6x=42)引自中国农业科学院原品种资源研究所。

2008年9月将亲本八倍体小偃麦，麦草8号和六倍体小黑麦，哈师209，播种于哈尔滨师范大学生物科学与技术学院温室，2009年2月以八倍体小偃麦，麦草8号为母本，六倍体小黑麦和哈师209为父本进行杂交，杂交方法同常规(赵海滨等, 2012)；2009年5月得到F₁代(AABBDER, 2N=49)种子，2009年9月将F₁代种子种于温室，进行细胞学观察，2010年5月得到F₂代(AABBD0-7E0-7R0-7, 2N=42~56 )种子，2010年9月将F₂代种子种于温室，2011年5月得到F₃代(AABBD0-7E0-7R0-7, 2N=42~56)种子，2011年9月将F₃代种子种于温室，2012年4月对90份材料进行分子检测和细胞形态学观察，选育抗病、多花、大穗、多小穗、籽粒饱满度较好等综合性状好的材料。

3.2形态学观察
依据《小麦种质资源描述规范和数据标准》对植株性状进行观察与分析，如株高、穂长、分蘖数、小穗数、百粒重、抗病性、再生和穗轴颈毛等(李立会和李秀全, 2006, 中国农业出版社, pp.1-86)。

3.3细胞学检测
花粉母细胞减数分裂观察：上午7:00-9:00在温室与试验田取材，所需材料是花粉母细胞为减数分裂中期的花药，用卡诺固定液固定，在65℃的1N盐酸解离，用希夫试剂染色，压片，镜检计数，照相(丁海燕等, 2008)。

根尖染色体数目观察：将种子放在23.5℃的恒温箱中培养24 h，种子发芽露白，转移到4℃冰箱中低温处理48 h，再放回23.5℃的恒温箱中促芽生长27.5 h，将根尖剪下，冰处理24 h，在4℃冰箱中用卡诺固定液固定16~24 h，用醋酸洋红染色，压片，镜检计数，照相(丁海燕等, 2008)。

3.4 DNA的提取
取叶片在液氮中研磨成粉末，用CTAB法提取小麦DNA(田再民等, 2009)。

3.5特异DNA探针引物的扩增
根据任如意等(2007)、刘成等(2007)、尤明山等(2002)方法合成特异性PCR引物(表1)，合成由大连宝生物公司完成。

表1 特异扩增PCR引物  Table 1 PCR primers for specific amplification

PCR扩增在Master cyclerPCR仪上进行，反应体系为25 μL，1×PCR Buffer，1.5 mmol MgCl2，200 μmol/L dNTP，0.5 U Taq酶，40 ng引物，40~60 ng模板DNA。R组反应条件为95℃ 3 min预变性，95℃ 30 s (变性)，55℃ 30 s (退火)，72℃ 1 min (延伸)，循环30次，72℃延伸10 min。E和St组反应条件为95℃ 3 min预变性，95℃ 1 min (变性)，52℃或53℃ 1 min(退火)，72℃ 2 min(延伸)，循环40次，72℃延伸10 min。PCR产物用0.8% Agarose胶(内加EB)在1×TAE电泳缓冲液上电泳，放置Bio-Rad紫外凝胶呈像系统下扫描照像。

作者贡献
厉永鹏、姜博和李宇新是实验研究的执行人；厉永鹏和张杰完成了实验的数据统计和结果分析；李集临和张延明是项目的构思者和责任人，指导实验设计，数据分析，论文修改。全体作者都阅读和同意最终文本。

致谢
本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA10010205)、黑龙江高校科技创新团队研究计划、哈尔滨师范大学科技创新团队研究计划(KJTD-2011-2)、哈尔滨师范大学博士科研启动基金项目(08XBSK87)共同资助。

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