水稻既是分子生物学研究的模式植物，也是主要的粮食作物(Eckardt, 2000)。水稻杂种优势的利用是提高产量的有效途径之一(谭学林和师常俊, 1999)。杂交水稻的成功得益于细胞质雄性不育基因及育性恢复基因(Fertility restorer gene, Rf)的发掘和利用。中国杂交籼稻的推广约占中国籼稻种植面积的80% (张宏根等, 2010)，占中国水稻种植总面积的57% (梁奎等, 2010)。日本在1966年就实现粳型杂交水稻的三系配套，中国也在1973年实现了滇Ⅰ型杂交水稻的三系配套(李铮友等, 1980, 云南人民出版社, pp.16-17)。但目前杂交粳稻的种植面积仍然很小，其中一个原因是粳稻种质不具有恢复基因Rf，而目前杂交粳稻的恢复系中所含的恢复基因均须通过籼粳杂交从籼稻中引入(李铮友等, 1980, 云南人民出版社, pp.16-17)。Rf-1为最先对BT型细胞质雄性不育定位的育性恢复基因，也是水稻上克隆的第一个恢复基因(Akagi et al., 2004; Komori et al., 2004; Wang et al., 2006)，籼稻中的Rf-1基因比粳稻中的该位点多出一段Rf-1D序列(Akagi et al., 2004; Komori et al., 2004; 谭亚玲等, 2009)。来源不同的栽培稻以及AA基因组中的野生稻在该位点的DNA序列间也存在丰富的变异(Kato et al., 2007)。在对云南地方老品种的研究中也得知，云南老品种在Rf-1位点的DNA序列结构也存在变异(寇姝燕等, 2009; 谭亚玲等, 2009)。

为探讨水稻Rf-1位点的DNA序列在不同水稻种质中的变异，本研究利用Rf-1位点上的特异性引物68923-8 (Akagi et al., 2004)对来源于国内外的籼粳稻恢复系和非恢复系材料进行PCR片段的克隆测序，分析不同材料Rf-1位点的序列变异。

1结果与分析
1.1籼粳稻及恢复系的PCR标记68923-8的基因型
 恢复基因Rf-1位点特异PCR引物68923-8对供试材料基因型分析揭示，籼稻材料具有大小约为1 900 bp的片段；粳稻材料出现两种带型：粳稻恢复系的带型与籼稻带型一致，而非恢复系材料具有的片段大小约为1 300 bp (图1)。

图1 供试材料68923-8片段的基因型 注: M: Marker 2000; 1~7泳道为籼稻恢复系或非恢复系(1: IR24; 2: 明恢63; 3: 93-11; 4: IR58025; 5: 巴-1; 6: 月亮谷; 7: 天杂57); 8~10泳道为粳稻恢复系(8: 南34; 9: C418; 10: Ansanbyeo); 11~16泳道为粳稻非恢复系(11: Krepish; 12: 意4313; 13: 江苏408; 14: 辽粳454; 15: 楚粳28; 16: 丽粳13) Figure 1 Genotype of 68923-8 fragment of materials Note: M: Marker 2000; Lanes 1~7 are indica restorers or non-restorers (1: IR24; 2: Minghui63; 3: 93-11; 4: IR58025; 5: Ba-1; 6: Yuelianggu; 7: Tianza57); Lanes 8~10 are japonica restorers (8: Nan34; 9: C418; 10: Ansanbyeo); Lanes 11~16 are japonica nonrestorers (11: Krepish; 12: Yi4388; 13: Jiangsu408; 14: Liaojing 454; 15: Chujing28; 16: Lijing13)

1.2恢复系间的序列比较
分析发现三个籼稻恢复系(红莲型恢复系93-11, 野败型恢复系明恢63及IR24)间的一致性为88.03%，变异位点为247 bp，达到13.24%。有意思的是野败型恢复系IR24与红莲型恢复系93-11的一致性较高，达到91.65%，变异位点数为130 bp，占片段全长的7%，而两个野败型恢复系IR24与明恢63的一致性却较低，为85.11%，变异位点较多，含有201 bp，占片段全长的11.27%。遗传距离分析也得到了类似的结果，明恢63与93-11的遗传距离最小，仅为0.063，明恢63与IR24的距离却较大，为0.114，三个恢复系的遗传距离平均值为0.086 (表1)。

表1 材料间Rf-1位点68923-8的PCR片段的遗传差异 Table 1 Genetic variation between materials at 68923-8 fragment on Rf-1 locus

三个粳稻恢复系(南34, C418与Ansanbyeo)间的一致性较籼稻恢复系间的低，为57.48%，变异位点为977 bp，占片段全长的51.97%。其中滇Ⅰ型恢复系南34与BT型恢复系C418的一致性较高，达到93.51%，变异位点数为55 bp，占片段全长的2.96%，但它们与来自韩国的滇Ⅰ型恢复系Ansanbyeo的一致性均较低，分别为39.81%，39.12%，变异位点分别为987 bp及960 bp，均占到了片段全长的一半以上。三个恢复系的遗传距离平均值为0.755，南34与C418的遗传距离较近，仅为0.007，但它们与Ansanbyeo的距离却分别为1.132及1.126，差异较大(表1)。

籼稻恢复系与粳稻恢复系的序列一致性为54.71%，含有1 224 bp的变异位点，占片段全长的63.62%。遗传距离分析表明，籼稻恢复系与粳稻恢复系间的遗传距离平均值为0.747 (表1)。

以上结果表明，籼稻恢复系间的一致性较高，粳稻恢复系间的一致性次之，籼-粳稻恢复系间的序列一致性较低。

1.3恢复系与非恢复系间的序列比较
籼稻恢复系与籼稻非恢复系二者间的序列一致性达到91.56%，变异位点为298 bp，占片段全长的15.94%；二者间的遗传距离平均值为0.049。籼稻恢复系与粳稻非恢复系二者间的序列一致性为55.83%，变异位点为359 bp，占片段全长的19.24%，平均遗传距离为0.149 (表1)。

粳稻恢复系与粳稻非恢复系二者的一致性较低，为36.53%，含有1 119 bp的变异位点，占片段全长的53.93%，二者间平均遗传距离为0.783。粳稻恢复系与籼稻非恢复系二者的一致性为55.2%，变异位点为1 156 bp，占片段全长的58.95%，二者间平均遗传距离为0.731 (表1)。

以上结果表明，籼稻恢复系与籼稻的非恢复系间的一致性较高，与粳稻非恢复系间的一致性较低。有意思的是，粳稻恢复系与籼稻非恢复系的一致性较高，反而与粳稻非恢复系的一致性较低。

1.4非恢复系的序列变异比较
籼稻非恢复系间的一致性较高，达到94.79%，变异位点为93 bp，占片段全长的5%，它们之间的平均遗传距离为0.012 (表1)。粳稻非恢复系间的一致性较籼稻间略低，为91.56%，变异位点数为160 bp，占片段全长的12.92%，它们间的平均遗传距离为0.044 (表1)。籼稻非恢复系与粳稻非恢复系间的一致性较低，仅为57.66%，变异位点数为324 bp，占片段全长的17.41%，它们间的平均遗传距离为0.117 (表1)。

结果表明，籼稻非恢复系间的一致性较高，粳稻非恢复系间次之，籼-粳稻非恢复系间的序列一致性较低。

1.5供试材料同源树的构建
根据遗传距离构建的供试材料的同源树分成三大枝。第一大枝含有8个材料，其中7个材料为籼稻恢复系及非恢复系，另外1个是粳稻恢复系Ansanbyeo，其中籼稻的恢复系93-11与非恢复系IR58025及巴-1聚为一个亚枝，同源性达到100%。另一籼稻恢复系IR24却与粳稻恢复系Ansanbyeo聚为另一亚枝，同源性达到88%。该结果虽与一致性的分析在数值上稍有出入，但相较于与其他材料，同源性仍为最高。第二大枝含有6个材料，均为粳稻非恢复系，其中江苏408与Krepish的同源性为100%。第三大枝含有两个粳稻材料-滇Ⅰ型恢复系南34与BT型恢复系C418 (图2)，同源性达到93.51% (表1)。同源树揭示，籼稻恢复系的同源性较高，粳稻恢复系Ansanbyeo与另外两个恢复系南34及C418的同源性较低。而籼稻非恢复系、粳稻非恢复系的同源性均较高。

图2 供试材料同源树的构建 注: 1: 巴-1; 2: IR58025; 3: 93-11; 4: 天杂57; 5: 月亮谷; 6: 明恢63; 7: IR24; 8: Ansanbyeo; 9: 辽粳454; 10: 意4388; 11: 丽粳13; 12: 楚粳28; 13: Krepish; 14: 江苏408; 15: 南34; 16: C418 Figure 2 Homology tree of materials Note: 1: ba-1; 2: IR58025; 3: 93-11; 4: Tianza57; 5: Yuelianggu; 6: Minghui63; 7: IR24; 8: Ansanbyeo; 9: Liaojing454; 10: Yi4388; 11: Lijing13; 12: Chujing28; 13: Krepish; 14: Jiangsu408; 15: Nan34; 16: C418

2讨论
2.1籼粳稻恢复系及非恢复系间的序列差异
育性恢复基因是杂交水稻的关键基因之一。恢复基因Rf-1是水稻上最早进行克隆分析的恢复基因(Akagi et al., 2004; Komori et al., 2004; Wang et al., 2006)。本研究利用PCR特异引物对来源不同的籼、粳稻恢复系及非恢复系Rf-1位点的DNA片段进行序列比对分析，可较好地揭示籼粳亚种间、籼粳恢复系间及恢复系与非恢复系间在恢复基因位点上的变异。本研究结果表明，籼稻非恢复系间及粳稻非恢复系间的一致性较高，都在91%以上。有意思的是由于粳稻恢复系的恢复基因都是通过籼粳交从籼稻引进的(杨振玉等, 1998; 洪汝科等, 2004)，籼、粳稻恢复系二者间的一致性应较高，但本研究结果却表明籼粳稻恢复系间一致性较低(表1)。这可能是因为，虽然通过籼粳交将籼稻的恢复基因导入粳稻，但粳稻恢复系经过多代选育过程，在该位点发生了一些不影响恢复功能的DNA碱基序列变化。粳稻恢复系发生的这些碱基变化是否可能与粳稻恢复系对生态条件的适应性有关还需研究。另一个有意思的结果是粳稻恢复系间一致性较低(表1)，这可能是因为它们的恢复基因的供体不同所致。

本研究发现粳稻的恢复系与非恢复系间序列一致性很低(表1)。这是因为粳稻非恢复系没有恢复基因的存在，这与前人发现的非恢复系材料在Rf-1位点上缺失了一段574 bp的片段的结果一致(Komori et al., 2004)。

本研究发现籼、粳稻恢复系间在恢复基因位点的DNA序列存在变异。这一结果可能揭示在恢复基因位点上并非所有的序列变化对育性恢复功能都有较大影响。该结果也带来一个值得思考的问题，这些恢复系序列上的差异是否与育性恢复功能的强弱有关?本研究的另一结果是籼稻恢复系与籼稻非恢复系间序列一致性较高(表1)，这结果暗示恢复基因序列的某些变异对于育性功能的影响是巨大的，即使变异较小，也可能决定是否具有育性恢复功能。对这两个结果的进一步研究将有助于具有强恢复性的恢复系的选育。

2.2基于Rf-1位点的聚类分析
本研究的聚类将供试材料分成三大类，一大类除来自韩国的恢复系Ansanbyeo外，都是籼稻，包括恢复系和非恢复系；另一大类都是粳稻非恢复系；第三大类只有两个粳稻恢复系。粳稻恢复系与非恢复系分别在不同的类别中，是因为粳稻本来是没有恢复基因的。虽然南34与C418分属于滇Ⅰ型和BT型的恢复系，但在聚类中同为一类，而且二者间的遗传距离是恢复系间最小的，这与杂交粳稻的育种实践的结果相一致，虽然C418是BT型恢复系，但对滇Ⅰ型细胞质不育系仍然具有良好的恢复性，主要是因为它们的恢复基因供体都是IR8 (杨振玉等, 1998; 洪汝科等, 2004)。

滇Ⅰ型粳稻恢复系Ansanbyeo与籼稻恢复系IR24同为一小类，都是籼稻类别中。该结果说明在Rf-1位点上二者的同源性较高，亲缘关系较近。Ansanbyeo为韩国地方粳稻与韩国引进的外来品种杂交的后代，其恢复基因来源于外来引进品种。因此推测，该引进品种可能与IR24有较近的亲缘关系。由于杂交粳稻上使用的多数恢复系的恢复基因来源较为单一(王三良和许可, 1996; 阳峰萍等, 2007; 谭亚玲等, 2009)，因此，可利用Rf-1位点的分子标记筛选候选恢复基因供体，创造新的恢复系。

2.3恢复基因与籼粳分化的关系
对籼粳分化的研究多集中在籼粳亚种的鉴别上(孙传清等, 1998; 张建勇等, 2005; 张武汉等, 2007; 谭亚玲等, 2009)。本研究以Rf-1位点PCR片段的序列为基础对籼粳亚种的分化作了尝试性研究。结果表明恢复基因Rf-1位点的DNA序列变异与籼粳分化关系紧密，说明，利用Rf-1位点的DNA序列变异对籼粳分化进行研究可能会更加深入的阐明籼粳亚种分化的遗传变异。

3材料与方法
3.1供试材料
供试材料为来源不同的籼稻及粳稻，共计16份。其中，籼稻7份(含2份野败型的优良恢复系, 1份红莲型的优良恢复系及4份非恢复系)，粳稻9份(含滇Ⅰ型和BT型优良恢复系各1份, 来自韩国的1份恢复系材料及6份非恢复系) (表2)。

表2 供试材料 Table 2 Materials used in research

3.2方法
3.2.1 PCR扩增及克隆测序
采用CTAB法(Murray and Thompson, 1980)分别提取16份材料的总DNA。PCR反应在Apploed Biosystems 2720 Thermal Cycler PCR仪上进行。PCR引物68923-8序列为：F：5’-tccctcctctaataggactg-3’；R：5’-ggtgtcgtataccactgtca-3’。PCR的反应体系为20 μL：Master mix 10 μL (内含dNTP, 10×Buffer及Taq酶)，前后引物各1 μL，DNA模板1 μL，剩余体积用双蒸水补足。扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，36个循环；72℃延伸15 min；15℃保存。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行胶检测。而后利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对目的片段进行胶回收，回收后的产物与pEASYTM-T1 Simple Cloning Vector进行连接，再转化到大肠杆菌DN5α中，在含有IPTG、x-gal和氨苄青霉素的培养基上进行蓝白斑筛选，将阳性(白色)菌落转移到LB液体培养基(含氨苄)中，摇菌过夜后进行PCR检测，将含目的片段的菌液测序。

3.2.2序列分析
通过DNAMAN进行供试材料间两两序列的比对，得到材料间序列一致性。分别以每个类群内(籼稻, 粳稻, 籼粳稻恢复系等)两两材料间一致性的简单算术平均值代表该类群的一致性，以两两类群间一致性的简单算术平均值代表两类群间的一致性。在Clustal X 1.8中进行全部序列的比对，以比对后的序列为基础，在MEGA 4.0中计算变异位点数及比例和遗传距离，并采用类平均法(UPGMA)法构建同源树。

作者贡献
何婷婷为本实验的设计者和执行人、论文初稿的写作人及修改者；朱高倩及徐莹洁协助完成论文修改及校对；金寿林、文建成及普世皇参与实验材料的种植及管理工作；谭学林为项目的构思者及负责人、指导完成实验设计、数据分析、论文写作及修改。全体作者均阅读本论文并同意最终版本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(31060058; 31060088)资助。

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