单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)是指由于单个碱基的替换，以及小片段的插入或缺失所引起的多态性(Mochida et al., 2003)。由于SNPs具有数量多、分布广和便于自动化检测等优点，能够有效应用于植物遗传多样性分析、分子标记辅助选择和遗传图谱构建等方面的研究(Ganal et al., 2009)。然而，目前多数的SNPs检测方法由于操作复杂、成本高，限制了SNP技术在非模式植物中的应用和推广(束永俊等, 2010)。酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS)技术，是利用酶切位点上的SNPs引起的目的片段酶切特性的改变而产生多态性(Tragoonrung et al., 1992; Konieczny and Ausubel, 1993)，可用于SNPs的检测。该技术具有操作简便、稳定性强、成本低等优点，已经广泛应用于水稻(Komori and Nitta, 2005)、大豆(束永俊等, 2010)等大田作物，以及猕猴桃(Zhou et al., 2011)、葡萄(Guo and Li, 2012)等林木作物的SNPs分型。

茶树是多年生木本植物，由于遗传背景复杂，其遗传育种研究远远落后于其它作物。近年来，多种分子标记，例如扩增片段长度多态性标记(amplified fragment length polymorphism, AFLP)、随机扩增多态性DNA标记(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、简单序列重复区间标记(inter simple sequence repeat, ISSR)、简单重复序列标记(simple sequence repeat, SSR)等，已经广泛应用于茶树的遗传多样性分析(王丽鸳等, 2009; Ma et al., 2010; 段云裳等, 2011)、种质资源鉴别(陈亮等, 2002; 刘本英等, 2009)，以及遗传图谱构建(黄建安等, 2005; Taniguchi et al., 2012)等方面的研究。但是，SNPs在茶树中研究的报导还比较少。黄建安等(2007)和金基强等(2010)分别使用PCR-SSCP-银染检测技术和简化EcoTILLING (ecotype targeting induced local lesions in genomes)技术，分析了茶树多酚氧化酶基因的SNPs分布。王丽鸳等(2012)建立了茶树EST-SNP开发体系，指出茶树编码区的SNP发生频率约为0.58%，并使用25对测序引物对候选SNPs进行重测序验证。张成才等(2012)建立了使用dCAPS方法检测茶树SNPs的方法，将8个茶树SNPs转化为dCAPS标记进行检测。目前，CAPS标记技术在茶树中已经有所应用(Kaundun and Matsumoto, 2003; Ujihara el al., 2011)，但利用该技术进行茶树SNPs分型的报导还比较少。

本研究根据从茶树表达序列标签(expressed sequence tag, EST)序列中发掘的候选SNPs，设计测序引物在茶树基因组DNA中进行扩增，使用PCR产物直接测序的方法在基因组DNA中进行确证，然后对检测到的SNPs进行限制性内切酶酶切识别位点分析，最后将SNPs转化为CAPS标记进行检测，并探讨研究结果。

1结果与分析
1.1候选SNP的重测序验证
本研究针对候选SNPs共设计了123对测序引物，其中有34对引物测序成功。在8个茶树品种(1~8号) (表1)中共检测到了162个SNPs (图1)，其中，碱基颠换类型(Transversion) SNPs有46个，碱基转换类型(Transition) SNPs有116个，二者之比(tv/ts)为0.4。

表1 供试25个茶树品种 Table 1 Twenty five tea cultivars used in this study

图1 重测序检测到的162个SNPs Figure 1 162 SNPs detected by resequencing method in 8 cultivars

1.2 CAPS标记的转化
使用CodonCode Aligner软件，选择了较常用的19种限制酶的参数对162个SNPs进行酶切识别位点分析，发现共有60个SNPs引起酶切识别位点发生改变。因为某些限制酶在一个片段中可能有多个酶切位点，使得酶切条带过多而难以分辨；或者酶切条带间差异较小，难以使用琼脂糖凝胶进行检测，因此需要对引起酶切位点改变的SNPs进行筛选，保留那些酶切带型易于分析的SNPs进行标记转化。通过筛选，共选出48个SNPs进行标记的转化。使用相应的限制性内切酶对这些SNPs所在片段进行酶切，并进行电泳检测。最终，有39个SNPs的酶切电泳谱带与所检测的SNPs相吻合，成功转化为CAPS标记(图2)，转化成功率为81.8%。引物及限制性内切酶信息见表2。

图2 HaeⅢ酶对引物con259在8个品种中的PCR扩增产物的酶切结果 注: M: DL1000 marker; 1~8: 1~8号品种PCR产物的电泳条带; 9~16: 8个品种PCR产物的酶切结果 Figure 2 The result of the amplicons of con259 digested by HaeⅢ Note: M: DL1000 marker; 1~8: PCR products of 1~8 cultivars; 9~16: The digestion results of these cultivars

表2 引物及限制性内切酶信息 Table 2 The information of primers and restriction enzymes

1.3遗传多态性分析
为了验证开发的CAPS标记在茶树遗传研究中的可用性，本研究随机选择了14个标记，在25个茶树品种中进行多态性分析。结果显示，13个标记表现出多态性，1个标记在供试品种中均为杂合。在13个多态性标记中，每个标记检测到的等位基因数为2；H_e和H_o分别介于0.044~0.509和0.044~0.917；PIC值在0.043和0.497之间，平均为0.311(表3)。
 

表3 13个多态性标记信息 Table 3 The information of 13 markers

2讨论
SNPs作为第三代分子标记，在植物遗传育种研究方面有巨大的优势，特别是对于构建植物高密度遗传图谱具有重要作用(Feltus et al., 2004)。但是由于多数的检测手段操作复杂、成本较高，限制了SNP技术的应用。目前，茶树SNPs的检测方法有SSCP技术、简化EcoTILLING技术、dCAPS技术和测序技术。SSCP技术容易受到多种因素的影响使灵敏度降低(黄建安等, 2007)。简化EcoTILLING技术可以对较大的DNA片段进行SNPs筛查并检测单倍型，但是难以用于特定SNPs的鉴定(金基强等, 2010)。dCAPS技术则是通过特殊的引物构建酶切位点，从而实现酶切检测SNPs，可以作为CAPS技术的补充。而测序技术在进行大量样本的SNPs分型时成本很高。与以上技术相比CAPS技术能够实现对已知SNPs的精确检测，而且在进行大样本SNPs分型时操作简便、成本低是一种较为理想的茶树SNPs检测手段。

本研究成功地将39个SNPs转化为CAPS标记进行检测，转化成功率达到81.8%，高于束永俊等(2010)在大豆中的转化率。这可能是因为本研究对SNPs进行酶切位点分析后又进行了一次严格的筛选，从而提高了转化率。另外，检测到的大量的SNPs也为这种严格的筛选提供了条件。本研究随机选择了14个CAPS标记进行多态性分析，最终有13个标记在供试品种中表现出多态性。然而，13个标记的平均PIC值为0.311，低于段云裳等(2011) (PIC=0.53)和刘本英等(2012) (PIC=0.797)使用SSR标记在茶树中的报导。造成这种差异的原因可能是，本研究的CAPS标记是基于EST-SNP开发的，而通常单个SNP的PIC值较低(Pootakham et al., 2011)。但是，SNPs在基因组中分布十分广泛，其数量上的优势会弥补单个标记多态性信息含量较低的不足。

CAPS方法检测SNPs具有许多优点的同时也受到一些限制，如：第一，由于一些SNPs没有引发内切酶识别位点改变，因此该方法不能检测所有的SNPs；第二，在同一片段中如果存在多个与目标SNPs所在识别位点相同的酶切位点，其酶切条带会较多从而难以辨别。这些缺陷仍然需要进一步的研究予以弥补。

本研究建立了将茶树SNPs转化为CAPS标记的方法，从而可以实现便捷地、低成本地进行茶树SNPs分型；同时，文中报道的新的CAPS标记可以用于茶树遗传育种方面的研究。相信该技术的应用必将大大促进SNP标记在茶树遗传育种研究中的应用。

3材料与方法
3.1实验材料
本研究共使用了25个茶树品种作为实验材料(表1)，皆取自杭州国家种质资源圃。采一片芽二叶期的叶片，使用改良的CTAB法提取基因组DNA (刘本英等, 2006)。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo fisher scientific, USA)检测DNA浓度，将其稀释到30 ng/μL备用。

3.2候选SNPs的重测序确证
本研究根据实验室前期从ESTs数据库中挖掘的候选SNPs (王丽鸳等, 2012)，使用Primer 5.0软件根据其侧翼序列设计测序引物，从8个茶树品种(1~8号)的基因组DNA中进行扩增(表1)，并进行重测序验证。使用25 μL的体系进行PCR扩增，其中包含1 U Taq酶，60 ng DNA模板，10×PCR Buffer (Mg²⁺ free)，2 mmol/L Mg²⁺，0.15 mmol/L dNTP，0.2 μmol/L引物，加ddH₂O至25 μL。PCR扩增程序为：94℃变性3 min，94℃ 30 s，退火30 s，72℃ 1 min进行35个循环，最后在72℃延伸10 min，4℃保存。使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。然后，分别对每一个品种，有单一条带的PCR产物进行双向测序。

3.3 CAPS标记的转化
使用CodonCode Aligner软件(http://www.codoncode.com/aligner/download.htm/)对测序结果进行序列比对，并对检测到的SNPs进行限制性内切酶识别位点分析，确定引发酶切位点改变的SNPs。然后，使用相应的测序引物扩增这些SNPs所在的片段(同3.2)，用限制性内切酶对扩增产物进行酶切(酶切条件参照限制性内切酶说明)，使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。最后，将酶切后的电泳谱带和所检测的SNPs进行比对。

3.4标记的遗传多态性分析
使用引物在25个茶树品种中进行PCR扩增(同3.2)，对扩增产物进行酶切并电泳检测(同3.3)。统计电泳谱带，使用Popgen软件(http://cc.oulu.fi/~jaspi/popgen/popgen.htm/)计算标记的期望杂合度(Expected heterozygosity, H_e)以及观测杂合度(Observed heterozygosity, H_o)。根据公式PIC=1-∑_i=1ⁿ X_i²，计算标记的多态性信息含量(polymorphism information content, PIC)，其中Xi表示第i种基因型出现的频率。

作者贡献
张成才是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；王丽鸳和韦康参与实验设计，试验结果分析和论文修改；成浩是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由现代农业产业技术体系建设专项资金(nycytx-23)和浙江省茶产业技术创新战略联盟专项资金共同资助。

参考文献
Chen L., Wang P.S., and Yamaguchi S., 2002, Identification of wild tea germplasm resources (Camellia sp.) using RAPD markers, Zhongguo Nongye Kexue (Scientia Agricultura Sinica), 35(10): 1186-1191 (陈亮, 王平盛, 山口聪, 2002, 应用RAPD分子标记鉴定野生茶树种质资源研究, 中国农业科学, 35(10): 1186-1191)

Duan Y.S., Jiang Y.H., Wang L.Y., Cheng H., Wang Y.H., and Li X.H., 2011, Analysis of genetic diversity and relationship of tea cultivars and lines suitable for making green and black tea using SSR markers, Zhongguo Nongye Kexue (Scientia Agricultura Sinica), 44(1): 99-109 (段云裳, 姜燕华, 王丽鸳, 成浩, 王玉花, 黎星辉, 2011, 中国红、绿茶适制品种(系)遗传多样性与亲缘关系的SSR分析, 中国农业科学, 44(1): 99-109)

Feltus F.A., Wan J., Schulze S.R., Estill J.C., Jiang N., and Paterson A.H., 2004, An SNP resource for rice genetics and breeding based on subspecies indica and japonica genome alignments, Genome Res., 14(9): 1812-1819

Ganal M.W., Altmann T., and Röder M.S., 2009, SNP identification in crop plants, Curr. Opin. Plant Biol., 12(2): 211-217

Guo D.L., and Li M., 2012, EST-SNP analysis of grape (Vitis vinifera L.) by CAPS marker, In: Institute of Electrical and Electronics Engineers (IEEE) (ed.), 2012 International Conference on Biomedical Engineering and Biotechnology, Institute of Electrical and Electronics Engineers (IEEE), Macau, China, pp.1449-1452

Huang J.A., Li J.X., Huang Y.H., Luo J.W., Gong Z.H., and Liu Z.H., 2005, Construction of AFLP molecular markers linkage map in tea plant, Chaye Kexue (Journal of Tea Science), 25(1): 7-15 (黄建安, 李家贤, 黄意欢, 罗军武, 龚志华, 刘仲华, 2005, 茶树AFLP分子连锁图谱的构建, 茶叶科学, 25(1): 7-15)

Huang J.A., Huang Y.H., Luo J.W., Li J.X., Gong Z.H., and Liu Z.H., 2007, Identification of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in polyphenol oxidase gene in tea plant (Camellia sinensis), Hunan Nongye Daxue Xuebao (Journal of Hunan Agricultural University (Natural Science Edition)), 33(4): 455-458 (黄建安, 黄意欢, 罗军武, 李家贤, 龚志华, 刘仲华, 2007, 茶树多酚氧化酶基因的SNP分析, 湖南农业大学学报(自然科学版), 33(4): 455-458)

Jin J.Q., Chen L., Yao M.Z., Wang X.C. and Ma C.L., 2010, Simplification of EcoTILLING technique for tea plant, Chaye Kexue (Journal of Tea Science), 30(1): 19-26 (金基强, 陈亮, 姚明哲, 王新超, 马春雷, 2010, 茶树简化EcoTI- LLING技术的建立, 茶叶科学, 30(1): 19-26)

Kaundun S.S., and Matsumoto S., 2003, Development of CAPS markers based on three key genes of the phenylpropanoid pathway in tea, Camellia sinensis (L.) O. Kuntze, and differentiation between assamica and sinensis varieties, Theor. Appl. Genet., 106(3): 375-383

Komori T., and Nitta N., 2005, Utilization of the CAPS/dCAPS method to convert rice SNPs into PCR-based markers, Breeding Sci., 55(1): 93-98

Konieczny A., and Ausubel F.M., 1993, A procedure for mapping Arabidopsis mutations using codominant ecotype-specific PCR-based markers, Plant J., 4(2): 403-410

Liu B.Y., Wang L.Y., Li Y.Y., Tang Y.C., He W., Cheng H., and Wang P.S., 2009, ISSR markers for discriminating tea germ- plasm resources from Yunnan province, Chaye Kexue (Journal of Tea Science), 29(5): 355-364 (刘本英, 王丽鸳, 李友勇, 唐一春, 贺魏, 成浩, 王平盛, 2009, ISSR标记鉴别云南茶树种质资源的研究, 茶叶科学, 29(5): 355-364)

Liu B.Y., Wang P.S., Zhou H.J., Ji P.Z., and Cheng Z.Q., 2006, The ISSR-PCR reaction system’s establishment about Yunnan section thea plant, Yunnan Nongye Daxue Xuebao (Journal of Yunnan Agricultural University), 21(S): 21-25 (刘本英, 王平盛, 周红杰, 季鹏章, 程在全, 2006, 云南茶组植物ISSR-PCR反应体系的建立, 云南农业大学学报, 21(S): 21-25)

Liu B.Y., Sun X.M., Li Y.Y., Huang A.P., Wang Y.G., Cheng H., Song W.X., Chen L.B., Duan Z.F., and Ma L., 2012, Analysis of genetic diversity and construction of DNA fingerprinting with EST-SSR markers for improved clonal tea cultivars in Yunnan province, Chaye Kexue (Journal of Tea Science), 32(3): 261-268 (刘本英, 孙雪梅, 李友勇, 黄安平, 汪云刚, 成浩, 宋维希, 陈林波, 段志芬, 马玲, 2012, 基于EST-SSR标记的云南无性系茶树良种遗传多样性分析及指纹图谱构建, 茶叶科学, 32(3): 261-268)

Ma J.Q., Zhou Y.H., Ma C.L., Yao M.Z., Jin J.Q., Wang X.C., and Chen L., 2010, Identification and characterization of 74 novel polymorphic EST-SSR markers in the tea plant, Camellia sinensis (Theaceae), Am. J. Bot., 97(12): 153-156

Mochida K., Yamazaki Y., and Ogihara Y., 2003, Discrimination of homoeologous gene expression in hexaploid wheat by SNP analysis of contigs grouped from a large number of expressed sequence tags, Mol. Genet. Genomics, 270(5): 371-377

Pootakham W., Chanprasert J., Jomchai N., Sangsrakru D., Yoocha T., Therawattanasuk K., and Tangphatsornruang S., 2011, Single nucleotide polymorphism marker development in the rubber tree, Hevea brasiliensis (Euphorbiaceae), Am. J. Bot., 98(11): 337-338

Shu Y.J., Li Y., Wu N.L.H., Bai X., Cai H., Ji W., and Zhu Y.M., 2010, Mining and identification of SNP from EST sequences and convertion of CAPS markers in soybean, Zuowu Xuebao (Acta Agronomica Sinica), 36(4): 574-579 (束永俊, 李勇, 吴娜拉胡, 柏锡, 才华, 纪巍, 朱延明, 2010, 大豆EST-SNP的挖掘、鉴定及其CAPS标记的开发, 作物学报, 36(4): 574-579)

Taniguchi F., Furukawa K., Ota-Metoku S., Yamaguchi N., Ujihara T., Kono I., Fukuoka H., and Tanaka J., 2012, Const- ruction of a high-density reference linkage map of tea (Camellia sinensis), Breeding Sci., 62(3): 263-273

Tragoonrung S., Kanazin V., Hayes P.M., and Blake T.K., 1992, Sequence-tagged-site-facilitated PCR for barley genome mapping, Theor. Appl. Genet., 84: 1002-1008

Ujihara T., Taniguchi F., Tanaka J., and Hayashi N., 2011, Development of expressed sequence tag (EST)-based cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) markers of tea plant and their application to cultivar identification, J. Agric. Food. Chem., 59(5): 1557-1564

Wang L.Y., Liu B.Y., Jiang Y.H., Duan Y.S., Cheng H., Zhou J., and Tang Y.C., 2009, Phylogenetic analysis of interspecies in section thea through SSR markers, Chaye Kexue (Journal of Tea Science), 29(5): 341-346 (王丽鸳, 刘本英, 姜燕华, 段云裳, 成浩, 周健, 唐一春, 2009, 用SSR分子标记研究茶组植物种间亲缘进化关系, 茶叶科学, 29(5): 341-346)

Wang L.Y., Zhang C.C., Cheng H., and Wei K., 2012, Characterization of EST-derived SNPs and development of SNP-markers in tea (Camellia sinensis), Chaye Kexue (Journal of Tea Science), 32(4): 91-98 (王丽鸳, 张成才, 成浩, 韦康, 2012, 茶树EST-SNP分布特征及标记开发, 茶叶科学, 32(4): 91-98)

Zhang C.C, Wang L.Y., Wei K., Cheng H., Bao Y.X., Liu B.Y., and Wang Y.G., 2012, Study of SNP and relative dCAPS markers in tea plant (Camellia sinensis), Chaye Kexue (Journal of Tea Science), 32(6): 51-56 (张成才, 王丽鸳, 韦康, 成浩, 包云秀, 刘本英, 汪云刚, 2012, 基于茶树SNP的dCAPS标记体系研究, 茶叶科学, 32(6): 51-56)

Zhou J., Liu Y.F., and Huang H.W., 2011, Characterization of 15 novel single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the Actinidia chinensis species complex (actinidiaceae), Am. J. Bot., 98(5): 100-102