苹果是中国第一大落叶果树，栽培面积和总产量均居于世界之首，但病毒病危害日益严重，尤其是受到潜隐性病毒侵染后，植株不表现明显症状，给病害防控带来了更大困难。据报道，在国内各大苹果产区，潜隐性病毒发生广泛，多数主栽品种和砧木普遍带毒，有些品种的带毒株率几乎达到100%，且田间的情况多为复合侵染，给果树生产造成了严重损失(王亚南等, 2010)。因此，病毒病的防控已成为中国苹果生产中一个重要课题。

迄今为止，国内外尚未筛选到用于防治病毒病的有效药剂。利用RNA干扰技术进行基因工程育种，可通过诱导转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing, PTGS)获得抗病效果，近年来已成为培育抗病毒植物新材料的有效方法。在已有的报道中，以病毒外壳蛋白(coat protein, CP)基因作为靶基因沉默的研究最为常见(Hily et al., 2007)。前人的研究认为，诱导转基因植株发生PTGS的效率最高可达100%，可以达到抗病毒的目的，而且这方面在作物上已有不少成功的例证(Smith et al., 2000; Kamachi et al., 2007)。但截止目前，将这一策略应用在苹果等落叶果树上比较成功的报道尚不多见。

本研究针对生产中普遍存在的3种潜隐性病毒，即苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus, ASGV)和苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus, ASPV)，分别克隆它们的CP基因保守区段，串联后作为干扰片段构建RNAi植物表达载体，农杆菌介导法遗传转化烟草，诱导转基因植株形成dsRNA，以期培育出兼抗这3种病毒的抗病植物新材料。

1结果与分析
1.1目标干扰片段的获得
以苹果叶片总RNA反转录后的cDNA为模板进行特异性RT-PCR反应，用各自的中后部保守区段特异引物进行PCR扩增后，分别克隆获得了ACLSV、ASGV和ASPV这3个病毒外壳蛋白基因的目的区段，将其分别转入PMD18-T vector，阳性克隆测序后进行核酸序列比对分析，结果表明：克隆获得的ACLSV CP基因片段长度为297 bp，与AF25127-5.1的一致性为88.9%，ASGV CP基因片段为304 bp，与GQ330293.1的一致性为96.0%，ASPV CP基因片段为301 bp，与HM12156.1的一致性为92.6%，说明这3个片段均位于目的基因上。利用重叠延伸PCR顺序连接的大片段转入PMD18-T vector，阳性克隆测序结果显示(图1)，同时含有这3个基因保守区段的片段ALV序列长度为902 bp，符合预期结果。

图1 串联基因片段ALV序列 Figure 1 Sequence of the tandem gene fragment of ALV

1.2入门载体pENTR-ALV的构建及其鉴定
将干扰片段ALV进行TOPO Cloning，经菌液PCR鉴定结果显示(图2)：以ALV-F和ALV-R作引物进行PCR扩增，阳性克隆扩增产物电泳出现了约900 bp大小的目标条带，和阳性对照结果相一致，符合预期片段大小(902+4=906 bp)；而以通用引物M13F和ALV-R为引物，PCR扩增的片段明显大于插入片段ALV的长度，说明串联基因片段ALV已连接进入pENTR/SD/D-TOPO载体。同时，阳性克隆进一步测序的结果显示：入门载体上干扰片段部分序列与目的基因片段的碱基序列完全一致，说明所构建的入门克隆载体pENTR-ALV上ALV片段插入方向正确。

图2 TOPO Cloning阳性克隆的PCR鉴定 注: M: DL2000 marker; 1: 阳性对照以ALV-F&ALV-R作引物PCR扩增结果; 2: 阳性克隆以ALV-F&ALV-R作引物PCR扩增结果; 3: 阳性克隆以M13-F&ALV-R作引物PCR扩增结果 Figure 2 PCR identification of positive clones of TOPO cloning products Note: M: DL2000 marker; 1: PCR products of the positive control using primers of ALV-F&ALV-R; 2: PCR products of a positive clone using primers of ALV-F&ALV-R; 3: PCR products of a positive clone using primers of M13-F&ALV-R

1.3 RNAi载体PH12-ALV的构建及其鉴定
先以ALV-F和ALV-R作引物对LR反应产物进行PCR初检，对电泳出现约900 bp片段的阳性克隆再进行进一步的酶切鉴定，结果显示：LR反应之后的重组质粒经XbaⅠ(图3A)和XboⅠ(图3B)单酶切后，均出现了大于2 kb的片段，明显区别于PHELLSGATE12空载切出的片段大小(XbaⅠ切出的片段为16904-15485=1419 bp; XhoⅠ切出的片段为14450-13021=1429 bp)，符合LR反应时内含子反向的预期结果(比内含子正向的预期结果多了1个内含子序列长度)，可判断出干扰片段ALV与载体上的内含子PdK形成了正确的发卡结构，RNAi载体PH12-ALV构建成功。

图3 目标载体PH12-ALV的酶切鉴定 注: A: XbaⅠ酶切鉴定; B: XboⅠ酶切鉴定; M: DL2000 marker; 1: pHELLSGATE12空载酶切结果; 2~4: PH12-ALV阳性克隆酶切结果 Figure 3 Restriction enzyme identification of the target vector PH12-ALV Note: A: Restriction enzyme identification of XbaⅠ; B: Restriction enzyme identification of XboⅠ; M: DL2000 marker; 1: Results of enzyme digestion of the empty vector pHELLSGATE12; 2~4: Results of enzyme digestion of the positive clones from PH12-ALV

1.4 RNAi表达载体PH12-ALV转化农杆菌及其鉴定
将LR反应后的RNAi载体PH12-ALV转化农杆菌菌株EHA105后，分别用3对引物(ALV-F&A-LV-R; P35S-F&ALV-R及Kan-F&Kan-R)进行PCR检测，结果显示(图4)：第1对引物PCR扩增后电泳出现约900 bp的片段，第2对引物PCR扩增后电泳出现的片段大小明显大于前者，第3对引物PCR扩增后电泳出现741 bp的预期片段，3对引物扩增的片段大小均符合预期结果，充分说明目标载体已转入农杆菌中。

图4 PH12-ALV转化农杆菌菌株EHA105阳性克隆的PCR鉴定 注: M: DL2000 marker; 1: ALV-F&ALV-R作引物; 2: P35S-F& ALV-R作引物; 3: Kan-F&Kan-R作引物 Figure 4 PCR identification of PH12-ALV positive clones transformed into Agrobacterium strain EHA105 Note: M: DL2000 marker; 1: PCR products using primers of ALV-F&ALV-R; 2: PCR products using primers of P35S-F&ALV-R; 3: PCR products using primers of Kan-F&Kan-R

1.5转基因烟草植株的获得及PCR检测
农杆菌介导法转化烟草叶盘后，在添加100 mg/L卡那霉素(Kanamycin, Kan)的选择分化培养基上继代1~2次，形成了大小不同的Kan抗性芽(图5A)。经继续培养和诱导生根后获得了完整的抗性植株(图5B)，提取部分抗性植株的基因组DNA，以ALV-F&ALV-R为引物进行PCR检测，结果显示(图6)：未转化植株的gDNA经PCR扩增，电泳未出现任何条带，而转基因植株的gDNA经PCR扩增，电泳出现约900 bp大小的条带，这表明RNAi载体上的外源基因片段ALV成功转入烟草中。

图5 转基因烟草植株的获得 注: A: 叶盘上发生的抗性芽; B: 抗性植株离体成苗 Figure 5 The transformed tobacco plantlets obtained by Agrobaterium EH-ALV Note: A: Kanamycin-resistant buds from leaf discs; B: A kanamycin-resistant tobacco plantlet formed in vitro

图6 转基因烟草阳性植株的PCR检测 注: M: DL2000 marker; 1: 未转化植株的PCR结果; 2~4: 转基因植株的PCR结果 Figure 6 PCR detection of transformed tobacco plantlets Note: M: DL2000 marker; 1: PCR results of non-transformed tobacco; 2~4: PCR results of transformed positive plantlets.

2讨论
近年来，利用植物病毒自身的CP基因片段构建RNAi载体、进行抗病毒转基因育种已成为当前最为有效的抗病育种策略。与常规基因工程手段相比，利用RNAi基因沉默技术具有诸多优点，(1)用作干扰片段的基因不需要病毒的完整基因，只需基因部分片段也可达到抗病效果；(2)转入的外源基因片段较小，利于载体构建和遗传转化；(3)入侵病毒的RNA在转基因植物体内可迅速被降解，病毒基因不表达蛋白质，转基因产品更加安全可靠；(4)单拷贝的转化子也能产生高度抗病甚至免疫的植株。最近以来，随着RNAi机理的逐步阐明和技术上的不断成熟，将这一策略用于植物抗病育种的研究也越来越多，如国内外研究者利用马铃薯Y病毒(potato virus Y, PVY) (朱俊华等, 2004)、烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV) (颜培强等, 2007)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV) (Kamachi et al., 2007)、番木瓜环斑病毒(papaya ringspot virus, PRSV) (张帆和姜玲, 2011)等病毒的CP基因片段构建了RNAi载体，并在转基因烟草或拟南芥上获得了抗病性的明显提高。

利用RNAi技术沉默苹果病毒来源的基因进行抗病毒基因工程的研究目前已有报道，但主要是针对某一种特定种类的病毒来进行的。如李诗林等(2012)从库尔勒香梨上克隆获得了苹果褪绿叶斑病毒的CP和MP基因保守区段并构建RNAi载体，在部分转基因烟草中延缓了病毒症状的发生。在中国的苹果生产上，由于几种病毒复合侵染的情况十分普遍，要想获得能同时抗几种病毒的转基因植物，就需要构建同时包含几种病毒CP基因的RNAi载体，才更符合实际需要。基于这一思路，本研究分别克隆了3种苹果潜隐性病毒(ACLSV, ASGV和ASPV)的CP基因保守区段，并依次串联形成干扰片段ALV，成功构建了用于植物遗传转化的RNAi表达载体PH12-ALV，并利用该载体通过农杆菌介导法成功转入烟草中，以期诱导转基因植株转录后形成双链RNA发夹结构和siRNA，发生PTGS，同时沉默掉这3种病毒基因以阻碍其对寄主植物的侵染过程，从而获得更广谱抗病的植物新材料。通过本研究，获得了同时含有3种苹果病毒基因保守片段的转基因烟草，为利用基因工程手段创制同时包含多个外源基因的抗病植物新材料奠定了基础。

3材料与方法
3.1材料
RNA提取所用植物材料为7年生“富士”苹果叶片，取自中国农科院郑州果树研究所品种试验园，转基因所用烟草材料为本氏烟(Nicotiana benthaminana)无菌苗，本实验室保存。载体pHELLSGATE12由澳大利亚CSIRO公司惠赠，pENTR^TM/SD/D-TOPO^®誖TOPO Cloning Kit和Gateway^®誖LR Clonase^®誖Ⅱ Enzyme Mix试剂盒为Invitrogen公司(美国)产品，PMD-18-T克隆试剂盒、DNA回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、M-MLV反转录酶、限制性内切酶(XbaⅠ, XhoⅠ)及PCR所用rTaq酶、dNTPs均为Takara产品，pfu DNA聚合酶为Fermentas产品，各种抗生素均为进口分装，其它试剂为国产分析纯，大肠杆菌(TOP10)和农杆菌(EHA105)感受态细胞均由本实验室制备，引物合成及测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

3.2方法
3.2.1目标干扰片段的获得
根据Genebank中公布的基因全长序列(ACLSV CP基因, 登录号为AF251275.1; ASGV CP基因, 登录号为GQ330293.1; ASPV CP基因, 登录号为HM1-25156.1)，分别在保守区设计引物(表1)。采用Trizol法提取叶片总RNA，在M-MLV反转录酶作用下合成cDNA第1链，再以此cDNA为模板进行PCR，用1.0% Agarose凝胶电泳检测目标条带，切胶回收后克隆到PMD18-T vector，将获得的3个重组质粒(分别命名为P18T-ACLSV, P18T-ASGV和P18T-ASPV)测序分析后保存备用。利用重叠延伸PCR技术(Ho et al., 1989)，将ACLSV、ASGV和ASPV 3个基因的保守区段顺序串联在一起(技术路线见图7)，将连接后的大片段ACLSV-ASGV-ASPV (命名为ALV)转入PMD18-T vector，用两端序列引物P1和P6进行PCR鉴定后，阳性克隆送样测序，序列正确的重组质粒命名为P18T-ALV备用。

表1 PCR扩增所用引物 Table1 Primers used for PCR amplification in this study

图7 利用重叠延伸PCR获得目的基因干扰片段的技术路线 Figure 7 The technology sketch of the targeted interference gene fragment gene obtaining via overlapping PCR

3.2.2入门克隆载体构建及其鉴定
在ALV序列上游引物5’端添加用于序列接头的4个碱基CACC (表1)，用pfu酶对P18T-ALV进行PCR扩增(退火温度为55℃)，产物经1.0% Agarose凝胶电泳后目标条带切胶回收，以获得含干扰片段(ALV)的平末端PCR产物。按照pENTR^TM/SD/ D-TOPO^®誖试剂盒说明书，构建6 μL TOPO cloning反应体系(田莉莉和牛良, 2012)，25℃反应30 min，连接产物热激法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，均匀涂布在含50 mg/L Kan的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养16 h，挑单克隆到含有相同浓度Kan的LB液体培养基中37℃震荡培养14 h，分别以ALV-F &ALV-R和M13-F&ALV-R作引物，进行菌液PCR鉴定，阳性克隆送样测序，序列正确的入门克隆载体命名为pENTR-ALV。

3.2.3 RNA干扰表达载体构建及其鉴定
将入门载体pENTR-ALV和目标载体pHELLSGATE12进行LR反应，按照Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix剂盒说明书构建10 μL反应体系，25℃条件下反应12 h后，加入蛋白酶K终止反应。反应产物热激法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，均匀涂布在含有100 mg/L壮观霉素(Spec, 抗性基因位于目标载体上)的LB培养基平板上，37℃倒置培养16 h，挑单克隆到含相同浓度Spec的LB液体培养基中37℃震荡培养14 h，先用ALV-F&ALV-R作引物进行PCR初检，1.0% Agarose凝胶电泳，出现预期条带的菌液进一步提取质粒，分别用XbaⅠ和XhoⅠ进行单酶切，并以pHELLSGATE12空载作对照(图8)，鉴定为阳性的RNAi载体命名为PH12-ALV (图9)。

图8 目标载体pHELLSGATE12的质粒结构 Figure 8 Construction of pHELLSGATE12 plasmid

图9 RNAi表达载体pH12-ALV的结构 Figure 9 Construction of the RNAi vector of pH12-ALV

3.2.4 RNAi表达载体转化农杆菌及鉴定
采用冻融交替法将PH12-ALV载体转化农杆菌EHA105感受态细胞，均匀涂布在含有50 mg/L利福平(Rifampicin, Rif)和100 mg/L Spec的YEB平板培养基上，28℃条件下倒置培养48 h，挑单克隆到含有相同浓度的Rif和Spec的YEB液体培养基中28℃震荡培养48 h，分别用ALV-F&ALV-R、P35S-F&A-LV-R以及Kan-F&Kan-R (预期片段741 bp)作引物，进行菌液PCR鉴定，1.0% Agarose凝胶电泳分析，阳性克隆即为植物表达载体，命名为EH-ALV。

3.2.5农杆菌介导法转化烟草及其转基因植株的PCR检测
28℃条件下，将EH-ALV菌液震荡培养至OD值约为0.5，离心后收集菌体，将烟草无菌苗叶片切成1 cm2左右的叶盘，用等体积MS液体培养基重悬后侵染叶盘15 min，平放在MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基上暗培养2 d，转至MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+Kan 100 mg/L+Cef 500 mg/L培养基上，在16 h/8 h光周期条件下培养，每15 d继代一次，30~40 d内将≥1 cm的抗性芽转入MS+NAA 0.2 mg/L+Kan 30 mg/L培养基，选取长势健壮、生根良好的Kan抗性植株，用CTAB法提取植物基因组DNA，以未转化的烟草植株为对照，用ALV-F和ALV-R作引物进行PCR检测，1.0% Agarose凝胶电泳分析。

作者贡献
田莉莉是本研究的实验设计和实验研究的执行人，也是项目的构思者及负责人，完成数据分析和论文的写作；牛良参与项目构思和部分实验研究，协助完成论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家863课题(2011AA10020405)资助。

参考文献
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