一串红(Salvia splendens Ker-Gaw1)属于唇形科(Labiatae)鼠尾草属(Salvia L.)，原产于南美巴西。作为园林景观、花坛布置和家居生活中最常用的红色草花，其市场需求量逐年增长(傅巧娟等, 2013)，新品种选育的进程也在加快(董爱香, 2009, 中国林业出版社, pp.264-268)。目前，中国一串红新品种不断推出。一方面，通过引种和试种，筛选适合中国栽培的优良品种(王庆菊等, 2003; 刘晓青等, 2012, 江苏农业科学, 40(12): 199-200)；另一方面，国内通过杂交及诱发突变的方法也不断培育出新的一串红品种(惠长敏等, 2004; 傅巧娟等, 2009; 洪培培等, 2012; 刘克锋等, 2012)。优良品种的引进和具备自主知识产权新品种的培育，都丰富了我国一串红种质资源。但是，在中国目前推广应用的一些品种中，有些来源不明，缺乏系谱方面的背景资料(田晔林等, 2006)，同时也存在着名称混乱、品种资源总体遗传变异情况不明等问题，给一串红育种工作带来一定的不便。因此，有必要开展一串红种质资源的遗传多样性研究，以深入了解中国一串红种质资源现状以及品种间的亲缘关系。

20世纪80年代以来，分子标记技术的发展为遗传多样性的检测提供了新的技术平台(邱芳等, 1998)，利用分子标记技术评价种质资源遗传多样性的有效性也已被大量研究所证实(高翔等, 2002)。目前，用于一串红品种间遗传多样性和亲缘关系分析的分子标记主要有RAPD (田晔林等, 2006; 胡国富等, 2009)和AFLP (杨建玉等, 2010)，但总体来看，所用标记单一，且材料数量偏少，不利于全面的反映现阶段中国栽培一串红品种资源的遗传变异情况。相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)是由美国加州大学Li和Quiros (2001)开发的一种新型分子标记技术，具有简便、稳定、多态性高、便于克隆目标片段等特点(昝逢刚等, 2009; 傅洪拓等, 2010; 缪体云等, 2010; Amar et al., 2011)。目前至少已应用于24种园艺植物的遗传多样性分析(王晓菡等, 2009)，我们也曾将其用于一串红诱变品种的鉴定(傅巧娟等, 2012)，但尚未以此开展一串红种质资源的遗传多样性分析。

本研究采用SRAP技术对目前中国一串红主栽品种进行遗传多样性评价，旨在了解其遗传变异情况，为中国一串红品种资源保护和育种利用提供理论依据。

1结果与分析
1.1 SRAP扩增的多态性
为了寻找多态性丰富的引物组合，从64对引物组合中筛选扩增条带清晰、重复性好的20对用于一串红的SRAP-PCR扩增。扩增片段大小在20~400 bp之间，共获得315个条带，其中多态性带114个，占36.2%；每个引物组合产生10~23条扩增带，平均15.75条，平均多态性带5.7条；引物之间多态信息含量PIC (polymorphism information content)的变化在0.104 9~0.981 5之间，平均为0.680 7；等位基因单体型数Ah (allele haplotype)变化于2~18之间，平均为8.2。总体来看，大部分引物组合都能够扩增出多态性谱带，以F4R1、F5R1、F6R2和F8R4表现尤为突出，Ah分别为15、16、12和18，PIC分别为0.947 5、0.981 5、0.972 2和0.981 5 (表1)，对不同种质基因型的鉴别能力较强。

表1 20对SRAP引物组合在18个一串红品种中的多态性信息 Table 1 Polymorphic information of 20 SRAP primer combinations among 18 S. splendens cultivars

1.2一串红品种间的遗传变异
 20对SRAP引物组合对一串红种质基因组DNA的扩增情况表明(表2)，从18个品种扩增出的片段数变化于252~273之间，平均为264个；多态性片段数在51~72之间，平均62.6个，多态性片段比例为23.70%。采用NTSYS-pc2.1软件计算出的品种间遗传距变化于0.016 6~0.129 0之间，平均0.069 2；18个品种的平均Shannon多样性指数仅为0.324 9。从遗传距离数据和这些较低的多样性指数可以看出，18个一串红种质基因组的遗传基础狭窄，多样性水平较低。

表2 18个一串红品种的SRAP扩增效果和Shannon多样性指数 Table 2 SRAP amplification and Shannon diversity index of 18 S. splendens cultivars

从所用的两大类材料来看，国产与进口品种间遗传距离的变化范围不大，平均值也比较接近，它们之间的差异未达到了显著水平(表3)，表明国内选育一串红品种与国外引进品种的遗传基础之间不存在显著差别，Shannon多样性指数也证实了这一结果。

表3 国产与进口品种的遗传距离参数和Shannon多样性指数 Table 3 Parameters of genetic distance and Shannon diversity index of domestic and exotic varieties

尽管总体上这些一串红品种的遗传变异较小，但在一些国内育成的和引进的品种中都检测到特有等位基因。如表4所示，能够检测到特异位点的引物组合有12对，占总数的60%；具有特异等位基因的品种有8个，占总数的44%。图1是其中2对引物组合(F1R4和F2R2)在两个品种(‘展望’和‘野火’)中所检测到的特有等位基因。这一结果既表明不同一串红品种间具有明显的遗传分化，也说明SRAP标记能够有效的鉴别不同品种间稀有的遗传变异，可作为一串红品种鉴定的可靠工具。

图1 2对SRAP引物组合对特有等位基因的扩增 注: M: 100 bp DNA ladder marker; A: 引物组合F1R4; B: 引物组合F2R2; 箭头所指位置为特异位点; 泳道编号与表5品种编号相对应 Figure 1 Private alleles detected by the amplification using SRAP primer pairs Note: M: 100 bp DNA ladder marker; A: F1R4; B: F2R2; Private alleles indicated by arrows; The lane code is corresponding to the variety code as listed in table 5

表4 12对SRAP引物组合在8个品种中所检测到的特异等位基因 Table 4 Private alleles detected in 8 varieties by 12 SRAP primer pairs

1.3聚类分析
非加权类平均法(unweighted pair-group method and arithmetic average, UPGMA)聚类分析结果表明(图2)，在遗传距离(GD)阈值为0.075处，可将18份材料分为3个类群。第Ⅰ类群中包括‘太阳神’、‘Pround Red’；第Ⅱ类群包括‘Vista Red’和‘展望’，表明这4个品种与其他品种的亲缘关系较远；其余14份材料都归为第Ⅲ类群。在遗传距离阈值为0.062处，第Ⅲ类群可进一步分为4个亚类：第1亚类将编号为14的‘Spicy Girl’单独区别开来；第2亚类只有编号为9的‘火娃’一个品种，说明‘Spicy Girl’和‘火娃’与同一类群其他品种相比遗传基础差异较大；第3亚类包括‘Scarlet King’、‘Scarlet Queen’、‘塞诺尔’和‘Firebird’；第4亚类来源广泛，包括‘红孩儿’、‘ St.John’s Fire’、‘奥运圣火’、‘野火’、‘篝火’、‘红塔’、‘神州红’和‘Emperor’。其中，‘神州红’与‘Emperor’之间的遗传距离最小，‘Spicy Girl’与‘展望’的遗传距离最大。从聚类的结果可见，不同地域来源的国产与进口一串红品种交错分布聚类，没有很明显的规律性，反映了一串红种质在不同地区和国家之间的流动性较大，引种交流导致某些基因的相互渗入，也可能与所选择的SRAP标记有关，导致种质间的遗传差异与地域来源之间没有必然的联系。

图2 18个一串红品种基于SRAP的UPGMA聚类图 注: 图中编号与表5品种编号相对应 Figure 2 UPGMA dendrogram of 18 S. splendens cultivars generated by SRAP markers Note: The code is corresponding to the variety code as listed in table 5

2讨论
DNA指纹数据及其标准化是品种审定和鉴别、特异性检验、新品种保护和利用的重要依据(徐坚等, 2008)，从DNA分子水平上进行品种鉴定具有准确可靠、成本低、自动化、不受环境影响等优点。SRAP标记是近几年才发展起来的一种基于PCR的新型分子标记(孙佳琦等, 2010)。本研究中SRAP-PCR扩增结果显示，20对引物组合在各品种间均有扩增，有效扩增率达100%；共获得315个扩增条带，其中114个是多态的，多态性比例占36.2%；平均每对引物可扩增5.7条多态性带，PIC值平均高达0.680 7；60%的引物组合可检测到特有等位基因。扩增结果说明SRAP标记可有效地用于一串红品种资源的遗传多样性分析，也可作为一串红品种鉴定的可靠工具。

从GD值和多样性指标数据来看，18个一串红品种间遗传距离总体偏小，GD值变化于0.016 6~0.129 0范围内，Shannon多样性指数平均也只有0.324 9，说明中国主栽一串红品种间遗传变异基础狭窄。这一结果与中国一串红遗传育种研究的实际情况也是相符的。首先，本研究使用的一串红材料有18个，涵盖了中国近年来的主栽品种，分析结果基本上反映了中国目前一串红栽培品种资源的遗传变异情况；其次，中国不是一串红的起源地，规模化生产的一串红多是进口品种，尽管通过杂交和诱发突变也选育了一些自主品种，但多是进口品种的衍生后代，缺乏广泛的遗传变异基础，本研究中两类品种比较的结果也证明了这一点；现代植物育种中资源的流动性较大，培育的新品种也常常异地引种或作亲本材料使用，这也会使得一些品种具有较近的亲缘关系。

本研究的结果为一串红资源的再收集、鉴定及新基因发掘、种质创新等研究提供参考，也有利于制定相应的育种策略，尤其是亲本选择与组配以及后代的辅助鉴定。首先，针对中国一串红品种资源遗传基础狭窄的现状，在加强种质资源收集的同时，应充分利用理化诱变技术和现代分子生物学技术，加强种质资源的创新研究，进一步丰富一串红种质资源的遗传多样性，为育种提供抗逆、抗病、抗虫和观赏性状优良的种质资源；其次，本研究所用的8个国外引进品种有4个检测到特有等位基因，国内育成的10个品种中也有4个检测出特有位点，这些特有的基因资源在以后的育种工作中应加以挖掘和利用，一方面分析这些特有位点的特性和功能，实现辅助鉴定和辅助选择，另一方面可将其作为首选的杂交亲本材料，使杂交后代具有更大的遗传变异；第三，本研究聚类分析的结果可为亲本的选配提供指导。目前杂交育种仍是一串红育种的主要方法，根据SRAP标记分析的结果，可选用亲缘关系较远、遗传基础差异较大的品种进行亲本组配，以避免因选配亲本间遗传基础狭窄而造成的育种效率低下。

3材料与方法
3.1植物材料
供试材料为18个红色一串红品种，其来源见表5。其中10个品种是国内育成的，8个是进口品种，基本涵盖了中国近年来栽培的一串红品种。以上材料于2011年春季栽植于杭州市农业科学研究院花卉园区的塑料大棚中，每品种200株，分3次重复，随机排列。试验期间各材料田间栽培管理条件一致。

表5 试验所用的材料 Table 5 Materials used in this experiment

3.2 DNA提取和质量检测
摘取幼嫩的一串红叶片，按照Doyle和Doyle (1987)的CTAB改良法提取基因组总DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，紫外分光光度计检测DNA的质量和浓度。统一稀释到50 ng/μL，-20℃保存备用。

3.3 SRAP扩增与检测
一串红SRAP-PCR体系(25 μL)包括1×PCR缓冲液、引物0.4 μmol/L，MgC1₂ 2 mmol/L、 dNTP 0.2 mmol/L 、模板DNA 50 ng和Taq DNA聚合酶1 U。其中的引物是根据Li和Quiros (2001)的设计原则设计的，正反向引物各8条(序列见表6)。扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 45 s，35℃ 1 min，72℃ 90 s，5个循环；94℃ 45 s，50℃ 1 min，72℃ 90 s，共35个循环；72℃延伸10 min，扩增产物于4℃保存(李春楠等, 2011)。参照Bassam等(1991)的方法，扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶110 V恒压电泳120 min，采用方卫国等(2000)的方法银染显影。引物和有关试剂均购自上海生工有限公司。

表6 本研究所用SRAP正反引物序列 Table 6 Sequences of SRAP forward and reverse primers used in the present study

3.4数据统计与分析
对凝胶上清晰、易读取的条带进行统计，以相同迁移位置上有带记为1，无带记为0，建立原始数据矩阵。运用NTSYS-pc2.1软件(http://www.exetersoftware.com/downloads/ntsysguide21.pdf/)处理数据，计算遗传距离(GD)，按照非加权类平均法(UPGMA)进行聚类分析(Nei and Li, 1979)。

有关多样性指数按以下公式计算：多态信息含量PIC=1-∑_Pi² (Botstein et al., 1980)；Shannon多样性指数I =-∑_Pi lnPi (Pi为第i个等位基因发生变异的频率)；多态位点比例PPL=(k/n)×100% (k为多态位点总数, n为检测到的位点总数)。

作者贡献
李春楠是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；傅巧娟和陈一参与实验设计，试验结果分析；李春楠和崔海瑞是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由杭州市科技发展计划项目(20120332H03)资助。

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