基因组测序的完成为基因克隆和功能研究提供了非常有用的信息。借助生物信息学技术强大的分析能力和基因释义开展候选基因的分析以及必要的功能验证实验，可以在较大的基因定位区间内达到对目标基因的克隆。如Hong等(2003)通过基因预测和测序分析，在60 kb的物理区间达到对控制矮杆等质量性状基因的分离克隆；Ishimaru等(2004)通过筛选8.8 cM区间内的基因释义信息和比较近等基因系间的生理生化特征实现了控制水稻株高QTL ph1基因的克隆和功能验证。El-Din El-Assal等(2001)在45 kb区域内(包含15个ORF)，利用侯选基因策略，成功克隆了一个控制开花期的QTL (CRY2)。此外，Hu等(2008)利用候选基因策略，实现了对水稻抗病QTL OsWRKY13、OsDR8、GH3-8和OsMPK6的分离和克隆。

细菌性条斑病(简称细条病)是水稻中的重要病害之一。水稻对细条病表现为数量抗性，目前已经定位了13个水稻细条病抗性QTL (Tang et al., 2000; 郑景生等, 2005; Chen et al., 2006)。其中，位于5号染色体短臂上的QTL qBlsr5a具有较大的表型效应(Tang et al., 2000)。本实验室Han等(2008)已将qBlsr5a定位在大约300 kb的范围内(RM153和RM159之间)。本研究在此基础上，利用生物信息学方法和释义数据库分析该定位区间内的所有注释基因，结合公共功能域分析软件，分析预测基因的保守结构域。根据植物抗病基因在各物种中有一定共性的特征，筛选具有已知抗病基因典型结构域或研究表明参与植物抗病性反应基因特征的注释基因作为初步的候选基因，利用荧光定量PCR技术，分析这些基因在细条病菌接种后的表达动态，确定差异表达基因，为qBlsr5a候选基因的最终确定提供帮助。

1结果与分析
1.1 qBlsr5a的目标区间内的基因预测
从水稻基因组相关注释数据库中查询到qBlsr5a的精细定位区间内共有53个预测基因，其中10个为未知蛋白，10个为转座子蛋白，33个有功能注释，占62.3% (表1)。分析具功能注释的基因信息和保守功能域，发现4个基因(LOC_Os05g01370, LOC_Os05g01380, LOC_Os05g01430和LOC_Os05g01444)含有抗病基因的典型结构域LRR，预测其编码多聚半乳糖醛酸酶抑制剂前体蛋白(polygalacturonase inhibitor precursor protein, PGIP)。前人研究认为，PGIP蛋白能够非竞争性地抑制病原菌的内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-polygalacturonase, endo-PG)的活性，增强植物的抗病性(武彦霞等, 2008)。此外，LOC_Os05g01550为C2H2型锌指蛋白，已知C2H2型锌指蛋白基因广泛参与植物生长发育和胁迫应答反应(Sakamoto et al., 2000)。LOC_Os05g01700推测具有ABC (ATP-binding cassette, ABC)转运子功能，已知植物ABC转运蛋白在外源毒素的解毒、植物抗病等一系列过程中都发挥作用(Krattinger et al., 2009)。LOC_Os05g01710预测为转录因子TFIIA_gamma (transcription initiation factor IIA gamma chain, TFIIA)，已知抗白叶枯病基因xa5和xa13的编码产物均为TFIIAγ转录因子(Anjali and Susan, 2004; Kottapalli et al., 2007)。LOC_Os05g01730推测具有干旱诱导蛋白Di19的结构域，参与抗逆反应；LOC_Os05g01780推测具有抗病基因的典型PK结构域。LOC_Os05g01810推测编码木质部的半胱氨酸蛋白酶前体，已知植物半胱氨酸蛋白酶的基因启动子中常含有胁迫响应元件(Nakashima et al., 2000)。因此，将以上10个预测基因(表1带部分)作为qBlsr5a的候选基因，利用荧光定量PCR分析各基因在抗、感亲本中接种后的差异表达情况。

表1 QTL qBlsr5a定位区间内的功能注释预测基因和部分RT-PCR分析引物序列 Table 1 Predicted genes in the QTL qBlsr5a mapping region and primer sequences used for qRT-PCR analysis

1.2候选基因的表达分析
用针刺法对感病品种H359及其抗病近等基因系H359-BLSR5A进行细条病菌接种，以蒸馏水模拟接种为对照，在接种后5个时间点提取水稻叶片总RNA。经BENKAN紫外分析仪分别测定表明，提取的总RNA光密度比值D260/D280均在1.8~2.0之间，D260/D230为2.10左右。凝胶电泳显示，总RNA的23S、18S条带清晰，同时可见5S (图1为部分样品的电泳结果)。这些结果表明：提取的总RNA较完整，质量符合RT-PCR实验要求。

图1 部分样品总RNA凝胶电泳结果(接种后6 h) Figure 1 The result of agarose gel electrophoresis of the total RNA from partial samples (6 h after inoculation)

以actin为内参基因，对筛选的10个预测基因进行定量PCR分析(表1)。结果表明：有2个基因(LOC_Os05g01550, LOC_Os05g01810)在抗、感材料中基本上没有检测到表达产物；7个基因(LOC_Os05g01370, LOC_Os05g01380, LOC_Os05g01430, LOC_Os05g01444, LOC_Os05g01710, LOC_Os05g01730和LOC_Os05g01780)在抗、感材料中的表达都没有明显变化；只有LOC_Os05g01700基因在抗、感材料中表现出明显的差异表达。由图2可见：与对照(模拟接种)比较，在H359中，LOC_Os05g01700在接种后6 h的表达水平表现为明显下调，并随时间推移继续下降，在24 h时达到最低，之后又慢慢回升，72 h时表达量几乎与对照一致(比值接近1)；在H359-BLSR5A中，该基因的表达水平在接种后6 h表现出一定的上调，但随后不断回落，24 h时降到最低并表现为略微下调，之后又略有回升，72 h时表达量几乎与对照一致。总的来看，LOC_Os05g01700在H359和H359-BLSR5A中的表达水平，除了在接种后6 h时表现出相反的调控方向之外，在随后的时间里则表现出相似的变化趋势，但在H359-BLSR5A中的变化幅度要比在H359中小得多，其表达水平变化倍数除了在6 h时间点之外，其它均未达到2倍，而这种轻微差异有可能是实验误差造成的。因此，可以认为，该基因在H359-BLSR5A中的表达受细条病菌侵染的影响不大。但在H359中，细条病菌侵染对该基因的表达有显著的抑制作用，并随着时间的推移而增强。不过，这种抑制作用在接种24 h之后就开始减弱，并且到48 h时就已经消失了。与此相对应，H359-BLSR5A与H359之间的表达水平差异在接种后6 h时已经非常显著，并随着时间推移而增大，至24 h时达到最大，高达25倍左右。但之后开始减少，到48 h时已经不显著了。根据这些试验结果，我们有理由认为，LOC_Os05g01700是qBlsr5a的一个重要的候选基因。

图2 细条病菌侵染下LOC_Os05g01700基因在抗、感材料中的表达动态 Figure 2 The expression dynamics of gene LOC_Os05g01700 in the resistant and susceptive materials under the infection of BLS pathogen

2讨论
一般而言，具有相同结构域的蛋白质，往往具有相同或者相似的功能。对植物抗病基因而言，它们在各物种中有一定的共性，大多具有相似的结构特征，参与相似的代谢反应，这是开展候选基因分析的有效前提。本研究通过生物信息学分析和定量PCR分析，初步推断LOC_Os05g01700是qBlsr5a的一个重要的候选基因。根据基因注释，LOC_Os05g01700可能具有ABC (ATP-binding cassette, ABC)转运子的功能。植物ABC转运蛋白是一个已知成员最多、功能最强大的家族之一，能进行主动运输，利用水解ATP释放的能量运载酶的底物穿过细胞膜和质膜，参与原核和真核生物的一些重要生理过程，包括抗病和抗逆反应过程。值得注意的是，已经成功克隆的对小麦条锈病、叶锈病和白粉病具不完全抗性的主效QTL Lr34属于ABC转运子家族(Krattinger et al., 2009)，该基因具有ABC转运子典型的细胞质核苷酸结合结构域(nucleotide-binding fold, NBF)和疏水跨膜结合域(transmembrane domain, TMD)。如此看来，同属ABC转运子家族的水稻LOC_Os05g01700基因参与到细条病的抗性中是完全有可能的，这进一步增强了推断它为qBlsr5a的候选基因的合理性。本研究将为最终克隆qBlsr5a的作用基因，揭示其抗病功能的分子基础提供重要的参考。

3材料与方法
3.1 qBlsr5a定位区间内预测基因的生物信息学分析
利用Gramene (http://www.gramene.org/)数据库和水稻基因组注释项目(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，搜寻qBlsr5a区间（约300 kb）内的预测基因及各基因的注释信息，利用HMMPfam预测注释蛋白的结构域，筛选具有抗病基因典型结构域或研究表明参与植物抗病性反应基因特征的预测基因。

3.2供试水稻材料的种植与接种取样
植物材料为高感细条病品种H359及其细条病抗性QTL qBlsr5a的近等基因系H359-BLSR5A。于2011年5月种植水稻材料。在水稻分蘖盛期，每株选取生长势一致的新生叶片，采用针刺法进行接种，每株接种多个叶片，每叶多个针刺点，严格设置无菌水接种(模拟接种)为对照。细条病菌株由华中农业大学成国英教授惠赠，接种前在28℃左右暗培养2~3 d，无菌水稀释后使用。在接种后6 h、12 h、24 h、48 h和72 h，剪取叶片接种点及其附近部分(约1 cm左右)，包于锡箔纸内，迅速放于液氮中冷冻并保存于-80℃超低温冰箱。

3.3 RNA提取及相关基因的表达分析
用百泰克通用植物总RNA提取试剂盒提取各样品总RNA，具体操作步骤见产品说明。RNA样品用BENKAN紫外分析仪测定和琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。每个RNA样品用反转录试剂盒Reverse Transcription Kit (Takara)反转录成cDNA。取适量的cDNA做模板，采用SYBR Premix Ex Taq (Takara)进行RQ-RT-PCR测定，具体操作步骤按产品说明书。对生物信息学筛选出的抗病相关基因，利用Primer 3.0软件设计定量PCR引物，由上海生工公司合成。PCR反应及数据采集在Bio-rad Mini Opticon系统上进行。以actin基因为内参，其正向引物为GATTGCCAAGGCTGAGTACGA，反向引物为AAAAGAGAGAAACAAGCAGGAGGA。以模拟接种为对照，每个反应设置3次重复。

作者贡献
吴为人、谢小芳和陈志伟是本研究的实验设计和实验研究的执行人；谢小芳完成实验结果分析以及论文初稿的写作；林德塨、许国泉和李春兰参与实验材料的准备及文献收集和整理工作；吴为人是项目的构思和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金项目(30971762)、福建省自然科学基金项目(2011J01089)和福建省创新训练项目(111ZC1248)共同资助。

参考文献
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