糖用甜菜是中国两大糖料作物之一，在北方农业生产中占有重要地位，在发展生产和改善人民生活方面起着积极的作用。甜菜生物产量高，需肥量大，吸肥时期长。在甜菜所需的全部营养中，氮素是影响产量的最关键、最活跃因素，氮素过量会造成甜菜含糖率和品质降低，氮素不足也会影响甜菜的产量(马凤鸣和高继国, 1996)。目前氮素利用率低成为近年来甜菜块根品质下降的主要限制性因素之一，提高甜菜氮素利用率可降低氮肥施用量，改善甜菜品质。

研究表明，NH₄⁺的流动需要氨转运因子(Brüggemann et al., 1999)。AtAMT1;1基因是目前对铵离子亲和性最高的铵转运因子，很多实验结果表明，AtAMT1;1的生理功能可能是将铵从低含量的土壤中吸收到植物根系，并灵敏地感知机体对铵的需求，吸收氮素的能力较强(Gazzarrini et al., 1999; Sohlenkamp et al., 2000)。张茹等研究表明，转高亲和铵转运蛋白基因微型番茄可以提高转基因番茄的抗低氮胁迫能力，同时显著提高叶片中的叶绿素含量(张茹等, 2006, 中国植物生理与分子生物学学会, pp.142)。因此，高亲和铵转运蛋白基因可以有效提高植物根系吸收氮素的能力。

本研究对转AtAMT1;1基因甜菜T₁代进行PCR、RT-PCR检测和低氮胁迫下转基因甜菜叶绿素、氨态氮含量分析，初步鉴定外源基因在转基因甜菜后代中的遗传、表达及功能，为改良甜菜提高氮素利用效率、创新甜菜种质资源提供理论依据和新途径。

1结果与分析
1.1转基因甜菜AtAMT1;1基因的表达
1.1.1质粒目的基因鉴定
农杆菌菌种涂平板培养，单克隆后提取质粒DNA，电泳结果如图1所示。

图1 质粒DNA PCR鉴定 注: M: DL3000 marker; 1~11: 质粒DNA的PCR Figure 1 PCR detection of the Plasmid DNA Note: M: DL3000 marker; 1~11: Plasmid DNA PCR

1.1.2转基因甜菜的PCR检测
分别取转基因甜菜新鲜叶片和根提取其基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳结果表现为基因组条带完整且无杂带，可以进行T₁代转基因甜菜的分子检测(图2)。

 

图2 甜菜基因组DNA琼脂糖凝胶电泳 Figure 2 Agarose gel electrophoresis of beet genomic DNA

图3显示1、3泳道没有扩增出相应的片段，说明PCR结果可靠，其余均扩增出相应的片段，初步证明AtAMT1;1基因能够传递到T₁代转基因甜菜植株中。

图3 转基因甜菜T1代植株PCR鉴定 注: A: 根; B: 叶片; M: DL3000 marker; 1: ddH2O; 2: 质粒(CK+); 3: 野生型(CK-); 4~9: 转基因甜菜 Figure 3 PCR detection of genomic DNA of transformed beet Note: A: Root; B: Leave; M: DL3000 marker; 1: ddH2O; 2: Plasmid (CK+); 3: Wild-type (CK-); 4~9: Transgenic beet

1.1.3转基因甜菜的RT-PCR检测
取甜菜块根样品迅速投放于液氮中冰冻提取总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA的质量，确定提取RNA完整，无降解。进一步分别以转基因植株和对照植株的cDNA为模板，以AtAMT1;1基因的特异引物进行PCR扩增反应，扩增片段大小约为184 bp (图4)。转基因甜菜植株中扩增出了特异条带，而野生型植株未出现阳性条带；表明AtAMT1;1基因已经整合到甜菜基因组中，能够稳定遗传和表达，且同一株系AtAMT1;1基因表达强度基本一致。

图4 RT-PCR结果 注: M: DL3000 marker; 1: ddH2O; 2: 质粒(CK+); 3: 野生型(CK-); 4~7: 转基因甜菜 Figure 4 RT-PCR results Note: M: DL3000 marker; 1: ddH2O; 2: Transgenic plants; 3: Wild-type (CK-); 4~7: Transgenic beet

1.2转AtAMT1;1基因甜菜功能鉴定
1.2.1低氮胁迫对甜菜叶绿素含量的影响
植物叶片叶绿素含量直接受植株氮素营养状况的影响。结果表明，无论正常供氮，还是低氮胁迫，转AtAMT1;1基因植株和野生型植株叶色对比，均表现出转基因植株叶色深绿，生长较快，而野生型甜菜叶色淡绿、叶小。由表1可以发现，NH₄⁺-N供应比正常减少25倍(处理Ⅰ)和无NH₄⁺-N供应(处理Ⅱ)时，野生型和转基因植株叶片叶绿素a，叶绿素b以及总叶绿素的含量均有所降低。在同一氮素水平下，转基因植株的叶绿素a、b及总含量均高于野生型，方差分析显示其差异达到显著性水平(α=0.05)，说明转AtAMT1;1基因甜菜明显可以提高甜菜叶片叶绿素含量。

表1 不同NH4+-N水平对甜菜叶片叶绿素含量的影响 Table 1 Effect of NH4+-N concentration on chlorophyll content of beet

1.2.2低氮胁迫对甜菜氨态氮含量的影响
图5显示，随着供氮水平的减少，转AtAMT1;1基因甜菜和野生型甜菜叶片氨态氮含量均有所降低；但转基因甜菜叶片氨态氮含量减少量低于野生型，如NH₄⁺-N供应比正常减少25倍(处理Ⅰ)时，转基因甜菜叶片氨态氮含量减少了12.7%，野生型减少了20.3%。在同一氮素供应水平下，转AtAMT1;1基因甜菜叶片氨态氮含量均高于野生型甜菜，方差分析达到显著水平(α=0.05)。3个处理条件下，转基因甜菜氨态氮含量分别比野生型高14.7%，22.5%和20.5%，说明转基因植株在低氮胁迫下仍能正常吸收和利用氮素。

图5 转基因甜菜与野生型氨态氮含量差异 Figure 5 Comparison of the ammoniacal nitrogen contents between transgenic sugerbeet and wild-type

1.2.3转基因甜菜根重、含糖率
研究测定了种植于温室的转AtAMT1;1基因和野生型甜菜的单株块根重量和含糖率，并计算了产糖量。结果显示(表2)，转基因甜菜和野生型甜菜单株块根平均重分别是180 g和230 g，产量偏低，可能原因是早期盆栽抑制了生长。转基因甜菜比野生型甜菜含糖率增加1.2度，单株产糖量高37%。转AtAMT1;1基因没有对甜菜的形态和生理代谢产生负面影响，并且由于提高氮素利用效率，从而提高了产量和含糖率。

表2 转基因和野生型甜菜产量, 含糖率及产糖量的比较 Table 2 Root yield, sugar content and sugar production between transgenic-beet and wild-beet

2讨论
植物转基因技术是通过各种物理、化学和生物的方法将目的基因整合到植物基因组中，使之正确表达，稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法(罗丰等, 2011)。王晓娇(2011)利用农杆菌介导法获得了含有AVP1基因的抗旱性甜菜植株。杜昕钰(2009)研究结果显示，T₁代转核糖体失活蛋白-RIPs-基因甜菜的遗传稳定性良好，转基因甜菜抗病性明显优于野生型。因此，转基因甜菜分子检测理想的前提下，功能的鉴定对其遗传稳定的评价也有重要的参考价值。本研究应用PCR和RT-PCR方法检测AtAMT1;1基因在T₁代转基因甜菜中的传递和表达，同时在不同条件低氮胁迫处理后，对转基因植株氨态氮、叶绿素含量进行了分析。研究结果表明，PCR、RT-PCR检测的T₁代转基因甜菜呈阳性；转基因植株的叶绿素和氨态氮含量比对照野生型甜菜均有所提高，且差异显著；转基因甜菜平均单株根重和含糖率都比野生型的高，初步证明转AtAMT1;1基因可提高甜菜氮素利用率。

Southern分子检测及转基因植株其它生理性状鉴定工作正在进行。

3材料与方法
本研究于2012年在内蒙古农业大学甜菜生理研究所实验室和温室中进行。

3.1实验材料
3.1.1植物材料
 转AtAMT1;1基因甜菜T₁代种子。T₁代取材于同一株系不同植株，纯合体。以未转基因(野生型)甜菜为对照。

3.1.2菌种材料
根癌农杆菌菌株LBA4404和质粒pCAMBIA1301。质粒载体组成如图6所示。

图6 质粒pCAMBIA1301结构示意图 Figure 6 The scheme of the Plasmid structure

3.1.3 LB培养基
1 L LB：酵母提取物5 g，NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，用5 mol/L NaOH调节pH值至7.5；固体培养基加1%琼脂(孙亚卿, 2007)。以上培养基用于农杆菌的接种和培养。

3.2盆栽实验设计
耐低氮胁迫实验由蛭石、细砂以1:1 (V/V)混合组成培养基质，等量分装到花盆里，净重2.05 kg，浇一定量的正常营养液(处理CK)。选取大小一致的野生型(WT)和转基因(T₁)甜菜种子，经消毒灭菌后播种于花盆中，1周浇1次营养液，定期补充蒸馏水，待全部出苗且正常生长后按照表3的3个处理分别浇不同的营养液，3次重复，处理40 d测定生理指标。正常营养液以Hoagland营养液为基础，稍作改动，处理Ⅰ和Ⅱ降低其中的(NH₄)₂SO₄用量，营养液配方见表3。

表3 3种营养液中大量元素用量 Table 3 The dosage of macro elements in three kinds of medium

3.3测定方法
3.3.1转AtAMT1;1基因甜菜的分子检测
3.3.1.1菌种的活化与质粒的提取
农杆菌的活化和质粒的提取参照郇志荣(2010)论文方法。

3.3.1.2转基因甜菜的PCR检测
CTAB法提取植株DNA。阳性对照：质粒DNA；阴性对照：未转化甜菜DNA；空白对照：ddH₂O。引物序列P1：AGATCTCAACATGTCTTGCTCGGCCA；P2：TAATCATCGCAAGACCGGCAACA，扩增片段长度为1 608 bp。扩增程序为94℃预变性5 min，94℃变性50 s，62℃退火50 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃终延伸10 min。25 μL常规反应体系。

3.2.1.3转基因甜菜的表达检测
采用Trizol法(郇志荣, 2010)分别提取转基因植株及未转基因植株的根系RNA，经纯化，反转录后得到cDNA，以所得cDNA为模板进行PCR检测。以质粒DNA为阳性对照，未转化甜菜DNA为阴性对照，ddH₂O为空白对照。扩增片段长度为184 bp。引物序列A1：AGATCTCAACATGTCTTGCTCGGCCA；A2：AAGCTGCATAGAGAAGACAAGGT。扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性40 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃终延伸10 min。25 μL常规反应体系。

3.3.2叶绿素含量和氨态氮含量的测定
叶绿素含量采用比色法(常福辰等, 2007)，氨态氮含量的测定采用改良茚三酮比色法。收获时测产检糖。实验数据使用Microsoft excel 2003、SAS9.0软件进行方差分析。

作者贡献
段娜是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；孙亚卿、于超和张永丰参与实验设计，试验结果分析；张少英是项目的构思着和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
 本研究由现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-210304)资助。感谢南开大学生命科学学院王宁宁教授为本研究提供农杆菌工程菌株。

参考文献
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