滇杨(PopµLus yunnanensis Dode)又称云南白杨，是我国西南地区特有的杨属(PopµLus L.)青杨派(Tacamahaca)树种之一，也是我国乃至世界少有的分布于低纬度高海拔地区的杨树资源。其水平分布于云南中部、北部及滇南的开远、蒙自和文山，贵州的威宁，四川西南部以及西藏的察禺、昌都等地，垂直分布于海拔1 300~3 200 m，部分山地可达到3 700 m，自然群体多沿山涧河(溪)流生长(何承忠等, 2004; 2010)。滇杨具有适应性强，生长快，成材期短，耐寒，易无性繁殖，抗叶锈病和叶斑病等优良特性，对其开发利用，一方面可为我国杨树育种提供新的基因资源，另一方面也能够为我国高原地区的绿化造林及短周期用材林的营造提供优质树种(何承忠等, 2004; 2005)。然而，滇杨萌枝能力较强，分枝多，影响了干形的通直度和出材率，加之蛀干害虫为害较普遍，制约了该树种的推广与应用。而在种质资源调查中发现，分布于相同地域或不同地域分布的滇杨，其分枝特性差异较明显(何承忠等, 2010)。本研究采用AFLP分子标记技术，对采集于四川省和云南省的56株滇杨优树基因组遗传变异、54株滇杨优树无性系3a苗木落叶期侧芽的基因表达谱进行了分析，以期为进一步阐明滇杨分枝特性差异的遗传机制及与分枝相关基因的定位、筛选和结构分析等奠定前期研究基础。

1结果与分析
1.1 56株滇杨优树DNA-AFLP结果分析
从42对AFLP引物组合中，共筛选出了扩增条带数量较多、100~800 bp范围内分布较均匀、条带清晰且多态性高的8对引物组合用于56株滇杨优树的DNA-AFLP分析(表1)。8对引物组合扩增得到条带数最少为51条，最多为72条，共扩增出有效条带数508条，平均每对引物组合扩增得到63.5条。从多态性条带百分率来看，E-CAC/P-CTT引物组合扩增效率最高，共得到53条有效条带，多态性条带百分率达到81.13%，而引物组合E-CGA/P-ATG相对扩增效率较低，多态性条带百分率为50.98%。8对引物共得到多态性条带数301条，平均多态性条带百分率为59.25%。

表1 DNA-AFLP引物筛选及扩增结果 Table 1 The result of selected primer combinations and amplification reaction

应用POPGENE version 1.31软件对滇杨56株优树DNA-AFLP标记统计分析。结果表明，滇杨总遗传多样性HT为0.112 5，群体内平均遗传多样性HS为0.109 9，群体间遗传分化系数GST=0.022 6，基因流Nm=21.64。由此可知，滇杨不同优树群体之间的遗传差异仅占总差异的2.26%，滇杨优树的遗传差异主要存在于群体内不同单株之间，2个群体之间存在着较高的基因交流。不同优树群体的遗传多样性指数表明(表2)，除有效等位基因数均为1.157 7外，四川优树群体的多态性条带数、多态带百分率、观测等位基因数、Nei’s基因多样性指数和Shannon’s信息指数等指标均略高于云南优树群体。AMOVA分析结果表明(表3)，使用1 000次随机模拟检测，滇杨2个群体间以及群体内不同个体间均存在着极显著差异(P<0.001)。由此可见，滇杨优树具有丰富的遗传变异，且四川滇杨优树基因组的遗传多样性较云南滇杨优树丰富。

表2 56株滇杨优树基因组AFLP遗传多样性统计 Table 2 Genetic diversity of 56 plus trees in Poplus yunnanensis

表3 滇杨2个优树群体DNA-AFLP标记的AMOVA分析 Table 3 AMOVA analysis of DNA-AFLP markers between two populations of plus trees in Poplus yunnanensis

应用NTSYSpc version 2.10e软件计算56株滇杨优树间的遗传相似系数并采用UPGMA进行聚类分析。结果表明，56株滇杨优树之间的遗传相似系数在0.707~0.967之间，平均遗传相似系数为0.826，说明56个无性系间的相似程度较高。其中，优树无性系LME037和LME038之间遗传相似系数最高，为0.967，表明二者之间亲缘关系最近，差异性最小；而优树无性系LMB011和QXJ021之间的遗传相似系数最低，为0.707，表明二者之间亲缘关系最远，差异性最大。

在相似系数为0.794时，滇杨56株优树聚分为2组(图1)。第1组由47株滇杨优树构成，其中采自四川的滇杨优树有31株，收集于云南的滇杨优树有16株。第2组包含了四川居群的滇杨优树7株，而云南群体的滇杨优树仅有2株，但分属于不同的亚分支。由此可知，滇杨优树的变异与地理来源没有严格的相关性。

图1 滇杨56株优树的DNA-AFLP分析聚类图 Figure 1 Dendrogram based on DNA-AFLP analysis of 56 plus trees in Poplus yunnanensis

1.2 54个滇杨优树无性系落叶期侧芽cDNA-AFLP结果分析
从36对E+2/P+3的AFLP引物组合中筛选出了条带较清晰、100~800 bp范围内条带分布较均匀的8对引物组合用于54个滇杨优树无性系3a苗木落叶期侧芽的cDNA-AFLP分析(表4)。8对引物组合共扩增得到总条带526条，其中，公共条带数91条，差异性条带数435条；平均每对引物组合扩增出65.75条带，平均每对引物组合得到54.38条差异性条带；8对引物扩增出的差异条带百分率变幅在72.06%~94.85%之间，平均为82.70%，引物组合E-TA/P-AGT扩增出的条带数及差异条带百分率最高，分别达到97条和94.85%，而引物组合E-TC/P-ATA扩增出的差异条带百分率最低，为72.06%。由此可见，在落叶期时，54个滇杨优树无性系苗木侧芽内基因表达的差异性较为丰富。

表4 cDNA-AFLP引物筛选及扩增结果 Table 4 The result of selected primer combinations and amplification reaction

参照总基因组遗传多样性分析方法，应用POPGENE version 1.31软件对54个滇杨优树无性系苗木侧芽cDNA-AFLP标记结果进行统计分析，结果显示，滇杨优树无性系苗木侧芽在落叶期时功能基因表达总差异H_T为0.165 6，群体内功能基因平均表达差异H_S为0.1626，遗传分化系数G_ST=0.018 2，基因流Nm=27.00。因此，在落叶期时，滇杨不同优树群体之间的功能基因表达差异仅占总差异的1.82%，群体内不同优树无性系之间的差异是滇杨侧芽功能基因组差异的主要来源，但2个群体之间存在着较高的基因交流。不同采集地优树无性系侧芽功能基因组的表达差异性指标分析表明(表5)，采集于四川的滇杨优树无性系的差异性条带数、差异性条带百分率、观测等位基因数、Nei’s基因多样性指数和Shannon’s信息指数等指标均略高于采集于云南的滇杨优树无性系。分子方差分析结果显示(表6)，方差变量的2.07%来源于群体间，群体内不同个体间的变异占总变异的97.93%，群体间和群体内不同个体间的差异达到极显著水平(P<0.001)，表明滇杨侧芽落叶期基因表达的差异性较大，且四川滇杨优树群体无性系苗木侧芽功能基因组在落叶期时的差异性表达较云南群体更为复杂。

表5 54株滇杨优树无性系落叶期侧芽cDNA遗传差异统计 Table 5 Genetic variance of lateral buds cDNA in defoliation period of 54 plus trees in Poplus yunnanensis

表6 滇杨优树2个群体cDNA-AFLP标记的AMOVA分析 Table 6 AMOVA analysis of cDNA-AFLP markers between two populations of plus trees in Poplus yunnanensis

基于cDNA-AFLP分析结果，应用NTSYSpc version 2.10e软件计算54个滇杨优树无性系间的遗传相似系数并采用UPGMA进行聚类分析。结果表明，54个滇杨优树无性系之间的遗传相似系数在0.643~0.871之间，平均遗传相似系数为0.750。无性系LME038和LME037之间的遗传相似系数最大，为0.871，表明二者之间的基因表达差异性最小；无性系LMB026和LML002之间的遗传相似系数最小，为0.643，表明两者之间的基因表达差异最大。

以遗传相似系数0.71为阈值，54个滇杨优树无性系可以划分为2组(图2)。第1组包括了52个滇杨优树无性系，其中，采集于云南的滇杨优树无性系全部聚分于第1组，但来自于同一采集地的优树无性系并没有聚集于相同分支。第2组仅包含2个无性系，均采集于四川美姑县，但采集于不同乡镇。由此可见，滇杨侧芽功能基因组的差异与地理来源没有直接的相关性。

图2 滇杨54个优树无性系的cDNA-AFLP分析聚类图 Figure 2 Dendrogram based on cDNA-AFLP analysis of 54 plus tree clones in Poplus yunnanensis

2讨论
杨树由于生长快，适应性强，木材用途广，在全球被广泛栽培，也是用材树种中研究最为深入的树种之一。随着分子生物学的发展，应用分子标记技术从DNA水平对杨树派间、派内种间以及种内的遗传多样性水平开展了大量的研究，结果显示杨属具有较高的遗传多样性水平，派间、派内种间以及种内不同个体之间蕴藏着丰富的遗传变异(李宽钰等, 1996; Dayanandan et al., 1998; Winfield et al., 1998; Saito et al., 2002; Peng et al., 2005; Olson et al., 2010; Du et al., 2012)。本研究采用AFLP分子标记技术，筛选出了8对引物组合对56株滇杨优树进行了DNA水平的遗传变异分析，得到总条带数508条，多态性条带数301条，平均多态性条带百分率为59.25%，表明滇杨也具有较高的遗传多样性。此外，滇杨不同居群之间的遗传分化系数较小(G_ST=0.0226)，存在着较高的基因交流(Nm=21.64)，与滇杨自然林分中雌株极其罕见，主要是通过大枝扦插或根萌等无性繁殖方式相符合(何承忠等, 2010)。同时，通过无性繁殖方式，能够将滇杨群体中因前期有性繁殖、遗传漂变、基因突变等产生的遗传变异固定并保存下来，从而维持了现存居群的遗传差异水平。

cDNA-AFLP技术结合了RT-PCR和AFLP技术，具有所需起始材料少(100~500 mg)、对反应模板与反应条件的要求不同、可重复性强(>95%)、cDNA相对简单从而利用2个选择性碱基即可实现cDNA-AFLP的饱和筛选等突出优点(Fukuda et al., 1999; 卢钢和曹家树, 2002; Bachem et al., 2010)，目前已被广泛应用构建转录图谱、定位目标性状位点、研究基因差异表达等方面(肖金平等, 2011; 申艳红等, 2011;刘雪梅等, 2012)。本研究应用cDNA-AFLP技术对54个滇杨优树无性系3a苗木落叶期侧芽内基因表达差异进行了析，筛选出的8对引物组合共扩增得到总条带526条，其中差异性条带数为435条，占总带数的82.70%，表明落叶期时滇杨侧芽内基因表达的差异性较为丰富。而cDNA不仅具有时空表达的特异性，还较为敏感地受环境条件的影响。滇杨优树无性系均栽植于相同环境之中，所采集的侧芽处于苗木的相同位置，消除了时空效应和环境效应对基因表达的影响，因此，本试验cDNA-AFLP技术检测到的基因表达差异，是滇杨不同无性系遗传基础差异导致的结果，也进一步说明了滇杨具有较高水平的遗传变异。

植物分枝发育在植物形态建成中具有非常重要的地位，尽管在环境因素的影响下植物分枝具有一定的可塑性，但总体而言分枝发育调控是受遗传因素控制的(Steeves and Sussex, 1989; Leyser, 2003; 巩鹏涛和李迪, 2005)。本研究结果表明，滇杨无论在基因组水平，还是在侧芽转录组水平均表现出了较高的遗传变异，为开展理想株型的滇杨优良无性系选育储备了较为丰富的育种资源，但也为后续开展调控分枝基因的定位和筛选等研究工作增加了难度。

3材料与方法
3.1供试材料
先后从四川省凉山州、云南省丽江市、曲靖市等滇杨天然林或人工林中，采用绝对值优树选择方法，选择群体内基本处于自然生长状态、人为干扰较少、生长健壮、干形通直圆满、无病虫害的成年优树63株，分别采集当年萌生的健壮枝条作为繁殖材料，制作约20 cm长的插穗进行扦插繁殖育苗。采用完全区组试验设计，4株小区，3次重复，于次年3月平茬后以株行距3 m×3 m定植于西南林业大学树木园。于春季萌芽后，每优树无性系任选1株采集嫩叶用于提取DNA。于10月进入落叶期时，在同一区组内，各优树无性系在小区内随机选取1株苗木采取主干中下部3颗侧芽混合后作为测试样本，提取总RNA。63株滇杨优树来源详见表7。

表7 63株滇杨优树来源 Table 7 63 plus tree source of Populus yunnanensis

3.2研究方法
3.2.1 DNA和RNA提取及双链cDNA合成
参照Muray和Thhmpson的标准酚/氯仿操作流程(Muray and Thompson, 1980)，采用SDS改良法提取总DNA，共得到符合质量要求的56株滇杨优树总DNA。侧芽去除鳞片后，采用改良的CTAB法提取其总RNA (车鹏燕等, 2012)，共提取出54个滇杨优树无性系3a苗木侧芽总RNA。按照TIANGEN公司Quant cDNA Synthesis Kit中介绍的方法合成第一条链。第二条链合成每管反应体系80 µL，其中，First Strand reaction mixture 20 μL，10×E. coli DNA ligase Buffer 8 μL，10 mmol/L dNTP mix 1.5 µL，0.1 mol/L DTT 3.0 µL，E. coli DNA ligase (60 U/μL) 0.125 µL，DNA polymerseⅠ (5 U/μL) 5 µL，RNase H (5 U/μL) 0.015 µL，加ddH₂O至80 µL。12℃温育2 h，22℃温育2 h；加入17 μL 0.2 mol/L EDTA，终止反应；加入1.5 mL (15 U) RNAase，37℃消化30 min；加入5 μL (3 U)的蛋白酶K，37℃消化30 min。双链cDNA合成后经过纯化，置于-20℃条件下保存备用。

3.2.2 AFLP分析
AFLP分子标记试验操作过程参照Vos等(1995)发表的方法进行。采用EcoRⅠ/PstⅠ内切酶组合进行基因组DNA和cDNA的限制性双酶切，预扩增反应选用E00/P00的引物组合方式，采用E₊₃/P₊₃引物组合方式用于DNA-AFLP的选择性扩增反应，而E₊₂/P₊₃选择性引物组合方式应用于cDNA-AFLP的分析，PCR仪型号为PTC-100^TM Thermal PCR。

3.2.3选择性PCR产物的电泳分离
在选择性PCR产物中加入1/3体积的双指标剂，混匀后在95℃下变性5 min，取出后立即放置于碎冰中，取6 μL上样到经过30 min预电泳的6%变性聚丙烯酰胺凝胶上，采用90 W恒功率进行电泳分离。AFLP指纹图谱采用硝酸银显影(Tixier et al., 1997)。

3.2.4数据统计与分析
依据AFLP指纹图谱上同一位点条带的“有”、“无”，分别计为“1”或“0”，形成0/1矩阵。应用POPGENE version1.32软件对滇杨优树及四川和云南2个滇杨优树群体分别进行相关遗传差异指标的统计分析，计算多态性位点数、多态性扩增条带比率(PPB)、观测等位基因数(Ao)、有效等位基因数(Ae)、Nei’s基因多样性(H)、Shannon信息指数(I)以及基因分化系数(GST) (Yeh and Boyle, 1997; 刘惠民等, 2008)。应用AMOVA 1.55软件进行分子变异方差分析(AMOVA) (Excofier, 1992)。应用NTSYSpc 2.0软件计算各优树无性系之间的遗传相似系数，采用UPGMA方法对各优树无性系进行聚类分析。

作者贡献
李里、江涛和王滨蔚是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成谱带判读、录入、分析及论文初稿的写作；吴海、周安佩和刘东玉参与分析样品的采集、实验设计、试验结果分析和论文修改；何承忠是项目的负责人，指导实验设计、数据统计与分析和论文修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然基金项目(30960320)、国家林业科研公益专项基金项目(201104076)和云南省中青年学术与技术带头人后备人才培养基金项目(2012HB021)共同资助。

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