番茄(Solanum Lycopersicon)又称西红柿、番柿，起源于热带、亚热带地区，属茄科(Solanaceae)番茄属(Lycopericon Miller)。由于其营养丰富，风味香郁，深受人们的喜爱，在世界各地被广泛种植，成为各国的主要蔬菜作物之一(中华人民共和国农业部, 2004)。同时，作为一种模式植物，番茄具有基因组较小、染色体图谱较清楚和遗传学基础雄厚等特点，因此进行遗传转化研究具有重要的意义。

首次获得的番茄转基因植株是由McCormick等(1986)研究得出的，之后番茄遗传转化就陆续得到了不断的发展。迄今为止，已经成功获得了抗虫(Perlak et al., 1991)、抗病(Kaniewski et al., 1999)、抗除草剂(Fillatti et al., 1987)、抗寒(Hightower et al., 1991)和耐储存(Smith et al., 1990)等多个品种，这些品种80%以上是通过根癌农杆菌介导的方法获得的(卢刚等, 2003; 王傲雪和陈秀林, 2011)。因为相比较于花粉管导入法和基因枪法，根癌农杆菌介导法具有操作方便、费用低廉、可插入外源基因片段大、拷贝数低且符合孟德尔规律等优点(方卫国等, 2002），在植物遗传转化方面被广泛的应用(张建成等, 2010)。尽管农杆菌介导番茄遗传转化的方法已经相对成熟，但还存在转化率低的问题(Sree Vidya et al., 2000; PozuetaRomero et al., 2001)。

本研究就影响农杆菌介导番茄遗传转化效率的主要因素包括外植体预培养时间、乙酰丁香酮浓度、菌液浓度、侵染时间和共培养时间等进行研究，获得了在农杆菌EHA105(pBI121)介导下，进行“中蔬四号”番茄遗传转化的稳定高效的体系，为今后的研究奠定基础。

1结果与分析
1.1预培养时间对番茄遗传转化的影响
选择培养2 d后，进行外植体GUS染色的结果表明，染色率均为100%，每个叶片上都有蓝色的斑点。比较几种预培养时间的染色效果，预培养2 d的外植体蓝色最深，预培养3 d的外植体蓝色斑点最多，但染色较浅，预培养4 d的外植体染色最浅而且斑点也最少。未经过预培养的外植体也可染色，但其染色效果明显不如经过预培养的外植体。

观察愈伤组织和抗性芽的诱导情况，未经过预培养的外植体在后续培养中，叶片卷缩，切口处褐化，渐渐死亡，抗性愈伤诱导率最低为15.41% (表1)。预培养2 d的外植体只有少数褐化死亡，抗性愈伤诱导率最高为73.42%，抗性芽诱导率也高达22.75%。预培养3 d及4 d的外植体，在选择培养基中生长时，叶片会膨大，但分化愈伤很少，抗性芽诱导率高于未经预培养的外植体，但低于预培养2 d的外植体。因此就GUS染色的效果和抗性芽诱导率的结果综合分析得出，最佳的外植体预培养时间为2 d。

表1 预培养时间对番茄遗传转化的影响 Table 1 Effect of preculture time on transformation of the tomato

1.2不同乙酰丁香酮浓度对番茄遗传转化的影响 
比较不同浓度乙酰丁香酮(AS)对外植体GUS染色的效果表明：当诱导培养基和共培养基中都不加入AS或只在诱导培养基中加入AS，而共培养基中不加时，叶片的蓝色很淡，且不明显；当在诱导培养基中不加，只在共培养基中加入时，叶片的蓝色随着AS浓度的升高颜色变深，染色效果明显高于只在诱导培养基加入AS的组合；当在诱导和共培养基都加入AS时，随着AS浓度的增加，蓝色斑点增多，且蓝色更深。这些结果表明，AS在GUS表达过程中起到很重要的作用，尤其是在诱导和共培养基中都加入时，GUS染色的效果最好。

统计抗性愈伤和芽诱导率的结果表明，当在诱导和共培养基中都不加AS，叶片在选择培养基中生长时，大部分叶片一个星期之内就会产生白化现象，少部分会慢慢分化出愈伤，但也要40 d左右，抗性愈伤和抗性芽诱导率最低为20%和8% (表2)。当只在诱导培养基中加入AS，只有加到300 μmol/L时，抗性愈伤和芽诱导率才能达到30%和12.8%，而只在共培养基中加入AS 100 μmol/L时，抗性愈伤和芽诱导率就已分别达到了26%和12.08%，这说明在共培养基中加入AS是必需的。当在诱导和共培养基中都加入AS 200 μmol/L、300 μmol/L时，抗性愈伤和抗性芽诱导率都高于其他组合，而且相互之间差异不显著。因此在诱导和共培养基中采用200 μmol/L或300 μmol/L均可，但考虑到成本，宜选用在诱导和共培养基中均加入200 μmol/L的乙酰丁香酮。

表2 不同乙酰丁香酮浓度对番茄遗传转化的影响 Table 2 Effect of different AS concentration on transformation of the tomato

1.3不同菌液浓度对番茄遗传转化的影响
不同菌液浓度侵染后外植体GUS染色的结果表明，GUS染色率均为100%，比较其染色效果，随着农杆菌菌液浓度的增大，GUS染色的颜色逐渐加深，蓝色斑点的数目也增多，说明菌液浓度与GUS基因的瞬时表达呈正相关关系。统计愈伤和抗性芽的诱导数据显示，当菌液OD₆₀₀值为0.2时，外植体在生长过程中受到抗生素的胁迫产生白化现象，愈伤和芽诱导率较低，分别为19.08%和16.00% (表3)。当菌液OD₆₀₀值为0.6时，抗性愈伤和芽诱导率最高，分别为70%和25.16%。当菌液OD₆₀₀值达到1.0时，在共培养过程中，叶片切口处会褐化，外植体周围农杆菌生长旺盛，转移到选择培养后，抗生素无法抑制农杆菌的生长，叶片受到农杆菌毒害，无法正常分化。综合上述分析，番茄外植体在菌液OD₆₀₀值为0.6的菌液中侵染，GUS染色效果较好，外植体受伤轻，抗性芽诱导率最高。

表3 不同菌液浓度对番茄遗传转化的影响 Table 3 Effect of different bacterium concentration on transformation of the tomato

1.4不同侵染时间对番茄遗传转化的影响
不同侵染时间后外植体GUS染色的效果表明，侵染时间越长，GUS基因瞬时表达的效果越好，侵染5 min时，叶片为浅蓝色，侵染15 min时，叶片呈现深蓝色。分析抗性愈伤和芽诱导率的数据得出，侵染时间为5 min时，外植体能正常分化，形成的抗性愈伤最多，抗性愈伤和芽诱导率最高，分别为75.83%和25.17% (表4)。侵染时间为15 min时，在共培养阶段，许多外植体切口处褐化坏死，边缘部位呈水浸状伤害，部分叶片失绿，叶片无法正常分化，抗性愈伤诱导率最低。综合分析得出，侵染时间为5 min对番茄的遗传转化最有利。

表4 不同侵染时间对番茄遗传转化的影响 Table 4 Effect of different infection time on transformation of the tomato

1.5不同共培养时间对番茄遗传转化的影响
经过不同共培养时间后，外植体GUS染色率均达到100%。比较几种处理，不经过共培养的外植体GUS染色阳性，但颜色很浅，染色的面积也较小。共培养3 d的外植体染色效果最好，颜色为深蓝色，共培养4 d的叶片染色为暗绿色，并且暗绿色斑点处有腐烂现象。

统计分析数据得出，未经共培养的外植体在选择培养基上生长时，部分叶片渐渐白化，叶片分化愈伤较慢。共培养2 d时，在共培养基上外植体周围农杆菌可以生长，但转移到选择培养基上后，农杆菌被抑制，外植体能正常分化，抗性愈伤和芽诱导率分别达到69.83%和25.08%。共培养到4 d时，大部分外植体被农杆菌包围，只有少部分可以转移到选择培养基中，在选择培养基上两周内基本全部死亡，抗性愈伤诱导率为0 (表5)。综上所述，2 d 是最佳的共培养时间。

表5 不同共培养时间对番茄遗传转化的影响 Table 5 Effect of different co-culture time on transformation of the tomato

1.6转基因植株的检测
通过遗传转化，我们获得了21株抗性植株。在后续的栽培中，由于失误死亡17株。将存活的4株抗性植株进行GUS染色和PCR检测，结果表明有3株为转基因植株，GUS染色为阳性(图1)，进行PCR扩增出了大约575 bp大小的片段(图2)，因此确定目的基因已整合到番茄染色体中。

图1 不同类型植株子叶外植体GUS染色效果 注: A: 非转基因; B: 选择培养2 d后; C: 转基因植株 Figure 1 GUS assay of different types of cotyledon explants Note: A: Non-transgenic plant; B: After selecting for 2 days; C: Transgenic plant

图2 转基因植株PCR检测 注: M: DL5000 DNA marker; V: pBI121阳性质粒; CK: 非转基因植株; 1~4: 抗性植株 Figure 2 PCR test of transgenic plants Note: M: DL5000 DNA marker; V: pBI121 positive plasmid; CK: Non-transgenic plant; 1~4: Resistant plants

2讨论
2.1预培养对转化的影响
预培养不仅能促进细胞分裂，便于伤口酚类物质的释放与累积，利于T-DNA转移并整合到植物细胞基因组。张赛群等(1999)通过比较经过预培养和未经过预培养叶片的转化率，发现预培养时间延长，抗性愈伤诱导率会下降，这可能是因为叶片的伤口在预培养过程中慢慢愈合，细胞不再敏感，不宜被农杆菌侵染。在番茄转化体系中，一般预培养时间为2~5 d。在本研究中，预培养2 d时，外植体GUS染色效果较好，抗性愈伤和芽诱导率最高。这与大部分的研究一致，说明番茄叶片在预培养2 d时，其再生能力和敏感性都较高，有利于侵染。

2.2乙酰丁香酮对转化的影响
乙酰丁香酮作为一种诱导性较好的酚类化合物，主要是用来诱导农杆菌Vir区基因的活化与表达，促进T-DNA的加工和转移。目前，在大多数的研究中，无论是诱导培养基还是共培养基，乙酰丁香酮的有效使用浓度一般在50~200 μmol/L (陈双臣等, 2010; 李梅兰等, 2006)。另外，也有研究者认为高浓度的乙酰丁香酮对叶片有毒害作用，但其毒害机制尚不清楚(邓艺等, 2010)。本研究中在诱导培养基和共培养基中均加入200 μmol/L或300 μmol/L均可，抗性愈伤和抗性芽诱导率差异不显著。

2.3菌液浓度和侵染时间对转化的影响
番茄遗传转化所用农杆菌菌液OD₆₀₀值大多介于0.2~0.6之间。对于侵染时间，大多在5~20 min。大多研究者是将菌液浓度和侵染时间结合起来，有的是菌液浓度OD₆₀₀值为1.0的菌液侵染30 min (唐微和朱名安, 2006)，有的是菌液浓度OD₆₀₀值为0.5的菌液侵染15 min (陈双臣等, 2010)。本研究通过比较得出最佳的菌液OD₆₀₀值为0.6，侵染时间为5 min。与前面的结果相比较，本研究得出的菌液浓度相对较大，侵染时间也较短，这可能是与菌株的毒性和实验材料有关，本研究所用的菌株是EHA105，实验材料是“中蔬四号”番茄品种，为以后的研究提供参考。

2.4共培养时间对转化的影响
外植体经侵染后，还需要与农杆菌共同生长一段时间，农杆菌质粒T-DNA才能整合到外植体中(张录霞等, 2008)。一般在番茄的转化过程中，共培养时间为2~3 d。本研究得出的共培养时间为2 d，与大部分的研究者一致，说明共培养2 d 对农杆菌介导番茄转化是最佳的。Turk等(1991)在研究时发现，当共培养基pH值为5.8，温度在20℃时，Vir区基因有最高的诱导活性。本研究中，共培养基采用的pH值为5.5，温度为23℃，能较好的诱导农杆菌的活性，有利于侵染。

3材料与方法
3.1材料
本研究所用番茄品种为“中蔬四号”，种子购于山西省农业科学院蔬菜研究所。所用农杆菌菌株为EHA105，内含质粒pBI121，该质粒携带有抗卡那霉素的nptⅡ基因和GUS报告基因。

3.2培养基
本研究所采用的基本培养基为MS和1/2MS (N/N有机)，内含30 g/L的蔗糖、6.5 g/L的琼脂和各种相应的激素，pH值为5.8，121℃高压灭菌20 min。配方参照张微等(2010)进行，具体操作如下：(1)播种培养基：1/2MS；(2)预培养基：MS+0.1 mg/L IAA+ 1.5 mg/L ZT。(3)诱导培养基：1/2MS，液体培养基，pH 5.2。(4)共培养基：MS+0.1 mg/L IAA+1.5mg/L ZT+5.5 g/L琼脂，pH 5.5。(5)选择培养基：诱芽培养基：MS+0.1 mg/L IAA+1.5 mg/L ZT；芽伸长培养基：MS+0.1 mg/L IAA+1.0 mg/L ZT+1.0 mg/L GA。灭菌后待培养基冷却至50℃左右时，添加终浓度为400 mg/L头孢霉素和50 mg/L卡那霉素。(6)生根培养基：1/2 MS+0.3 mg/L IAA。

3.3农杆菌的活化
挑取农杆菌接入YEB液体培养基中(含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L链霉素)，28℃ 200 rpm摇菌过夜。当菌液生长至对数期时，将菌液离心，收集沉淀，用诱导培养基将沉淀重悬，再在28℃ 200 rpm 条件下诱导4~5 h待用。

3.4番茄的遗传转化
番茄种子先用70%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用20%的次氯酸钠灭菌10 min，最后用无菌水冲洗3~5次，将种子播种在1/2MS培养基上，培养温度为25℃，光照时间为光/暗：16 h/8 h。待无菌苗两片子叶完全展开时，将其子叶去掉基部和尖部，切成5 mm×5 mm大小，背面朝上接入预培养基中，预培养结束后，叶片放入菌液中侵染，侵染结束后用滤纸吸干叶片表面多余的菌液，将叶片接入共培养基中，在23℃黑暗条件下培养。共培养结束后，将叶片接入选择培养基中，每2周转接1次，待有丛生抗性芽时转入芽伸长培养基中，当抗性芽长至2 cm时，从外植体上切下，转入生根培养基，植株生根后就可移栽到花盆中。

3.5外植体预培养时间的确定
将分别经过预培养0、1 d、2 d、3 d和4 d的叶片外植体放入到OD₆₀₀值为0.6的菌液中侵染5 min，共培养2 d后，转移到选择培养基中。每个处理采用90个外植体，重复3次。选择培养2 d后，取10个外植体进行GUS染色，并观察之后愈伤的诱导情况，统计GUS染色率和抗性愈伤和芽诱导率，以确定外植体预培养的最佳时间。

3.6乙酰丁香酮浓度的确定
诱导培养基中加入浓度分别为0、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L的乙酰丁香酮，诱导培养4~5 h后，侵染预培养2 d的叶片，侵染时间为5 min，之后将外植体放入加有0、100 μmol/L、200 μmol/L和300 μmol/L乙酰丁香酮的共培养基中，共培养2 d。试验采用完全随机设计，共16个组合。之后进行GUS染色和愈伤及芽的诱导，方法同3.5，从中确定乙酰丁香酮的最佳浓度和组合。

3.7农杆菌菌液浓度的确定
将预培养2 d的叶片外植体在OD₆₀₀值分别为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0的农杆菌中侵染5 min后，共培养2 d，再转接到选择培养基中，之后观察愈伤和芽的诱导情况及GUS染色结果，方法同前，以确定菌液的最佳浓度。

3.8侵染时间的确定 
将预培养2 d的叶片外植体在OD₆₀₀值为0.6的农杆菌中分别侵染5 min、10 min和15 min，共培养2 d后，转接到选择培养基中，并观察愈伤和芽的诱导情况及GUS染色结果，方法同前，以确定侵染的最佳时间。

3.9共培养时间的确定
预培养2 d的叶片外植体在OD₆₀₀值为0.6的农杆菌中侵染5 min后，分别共培养0、1 d、2 d、3 d和4 d后，转接到选择培养基中，之后比较不同共培养时间下愈伤和芽的诱导情况及GUS染色情况，方法同前，以确定最佳的共培养时间。

3.10转基因检测
3.10.1 GUS染色
将外植体放入GUS染色液中，置于37℃恒温箱中过夜，之后用无水乙醇脱色，直到完全脱色后，观察GUS染色的效果。

3.10.2 PCR检测
用CTAB法提取番茄总DNA，以nptⅡ基因设计引物进行PCR 扩增，上游引物为：GCTATGACTGGGCACAACAG，下游引物为：ATACCGTAAAGCACGAGGAA。PCR反应体系为：ddH₂O 17.75 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、10 μmol/L引物各1 μL、Taq酶 0.25 μL、模版DNA (约10 ng) 0.5 μL，共25 μL。PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃终延伸5 min。扩增后的PCR产物取15 μL在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

作者贡献
李梅兰是项目的负责人，王婷婷和银利辉是本研究的实验设计和实验研究的执行人，侯雷平和高行英帮助进行了实验的构思、数据的分析和文稿的校对，并在实验过程中提供了一些帮助。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由山西省农业科技攻关项目(20090311022; 20110311015-1)和省人事厅人才引进项目共同资助。

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