青天葵为岭南道地贵重药材，来源于兰科植物毛唇芋兰Nervilia fordii (Hance) Schltr.的叶片或全株，具有润肺止咳、清热解毒、散瘀止痛的功效，对小儿呼吸道疾病疗效显著，市场需求量大(陈蔚文, 2010, 广东科技出版社, pp.318-334; 梅全喜, 2008, 中国药房, 29(18): 1426-1428)。由于遭到人类过度开采和自身种子萌发条件苛刻，野生青天葵已面临枯竭(文和群等, 1993)，组织培养和人工栽培是目前尝试获得青天葵资源的主要途径(杜勤等, 2005; 李斌等, 2008; 李守岭等, 2009; 张晓丽等, 2012; 杜勤等, 2005, 中药材, 28(10): 869-870)。然而，人工栽培和组织培养分别面临着种苗稀缺和“炼苗下田”、扩大种植等瓶颈问题，通过这两种方法获得的青天葵远远不能满足市场和临床需求。应用生物技术增大植物叶片等器官大小来提高药材产量，是缓解当前青天葵资源严重匮乏现状的可考虑途径之一。

植物器官大小生长与两个过程有关：细胞增殖和细胞扩张。不同的细胞数目或体积都将导致植物器官大小不同(王保和高建伟, 2009)。表皮生长因子受体3结合蛋白(ErbB3 binding protein, EBP1)包含p42和p48两个亚型，归属于细胞增殖蛋白2G4 (proliferation associated 2G4, PA2G4)家族。在表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)的刺激下，p42亚型依赖于EBP1自身的蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)调控的磷酸化作用与ErbB3结合(Yoo et al., 2000; Liu et al., 2006)。EBP1通过降低内源性RBR1 (Retinoblastoma-related 1)蛋白水平，释放出细胞周期相关基因所依赖的转录因子E2F，从而促进细胞增殖和扩张。因此，植物EBP1被认为是一个高度保守的、通过RBR1蛋白水平影响分生组织的分生能力和细胞增殖的，并呈剂量依赖性调控细胞生长的调控子(Horváth et al., 2006; 黄琼林等, 2012)。
 本研究应用RACE-PCR技术从青天葵的叶片中克隆EBP1基因，命名为NfEBP1，通过生物信息学初步分析基因的功能，并探讨基因在青天葵不同组织部位的表达水平，为进一步在模式植物中验证该基因功能,以及利用该基因调控青天葵器官生长奠定基础。

1结果与分析
1.1 NfEBP1的克隆及序列分析
通过对转录组Unigene数据库的注释和筛选，获得NfEBP1长度为1 185 bp的Unigene片段。5'R- ACE扩增获得约600 bp片段(图1A)，3'RACE巢式扩增获得约1 000 bp片段(图1B)。将RACE-PCR和Unigene片段序列进行拼接，获得NfEBP1的cDNA全长，共1 486 bp。Omiga2.0软件分析结果表明，该序列包含5'端166 bp非编码区，1 188 bp的开放阅读框架(从167位碱基到1位碱基到1 354位碱基)和3'端113 bp非编码区，最后以polyA结尾。开放阅读框架编码395个氨基酸。

图1 NfEBP1的PCR扩增电泳图 注: A: 5'RACE扩增产物; B: 3'RACE扩增产物; C: 编码区扩增产物 Figure 1 Agarose gel electrophoresis analysis of NfEBP1 Note: A: Amplification product of 5'RACE; B: Amplification product of 3'RACE; C: Amplification product of ORF

根据获得的cDNA序列全长引物NBOF/NBOR并进行编码区扩增验证，获得约1 200 bp产物，与预期结果相一致(图1C)。测序得到1 208 bp插入序列，根据重组子测序结果，修正拼接序列中的3个编码区核苷酸位点。向Genbank提交青天葵EBP1基因的编码区及其氨基酸序列，获得序列登记号分别为JN854245和AFG29445。

1.2 NfEBP1生物信息学预测和分析
ProtParam在线工具预测NfEBP1编码蛋白分子量为43.5 kD，等电点为6.12。ProtScale在线软件分析结果显示，NfEBP1编码蛋白疏水性最大值为2.211 (I₁₂₀)，最小值为-3.556 (G₃₇₁)，表明其整体呈亲水性。亚细胞定位分析结果表明NfEBP1没有信号肽、线粒体靶向肽或叶绿体转运肽。跨膜结构域在线预测结果显示，NfEBP1不具有跨膜结构域，整个多肽链位于膜外(图2)。

图2 NfEBP1跨膜结构预测 Figure 2 Transmembrane prediction for NfEBP1

二级结构预测表明，NfEBP1蛋白由152个氨基酸组成21 个a-螺旋、86个氨基酸组成的21个延伸链、40个氨基酸组成的18个β-转角和117个氨基酸组成的28个随意卷曲组成，它们分别占41.77%、15.95%、7.59%和34.68%。NfEBP1蛋白归属于APP_ MetAP超级家族，该家族成员包括氨肽酶P、氨肽酶M和脯氨酰氨基酶(二肽)酶等，在调控细胞生理过程有着重要作用。NfEBP1保守功能域集中在第20个到第330个氨基酸之间的序列，包含了位于19个到196个氨基酸之间的PA2G4 (proliferation associated 2G4)功能域(图3)，预示NfEBP1具有调控细胞增殖和扩张的功能。

图3 NfEBP1保守功能域预测 注: a: APP_MetAP supe Figure 3 Conserved domains prediction for NfEBP1 Note: a: APP_MetAP supe

1.3同源性比对
NfEBP1与来源于沙冬青和土豆的AmEBP1、StEBP1蛋白有较高的同源性，分别达到82%和86%。同源区域主要集中在N端，具有较高的连续相似性(图4)。NfEBP1与功能已鉴定的AmEBP1和StEBP1蛋白归属于APP-MetAP超级家族，而且它们的PA2G4功能域均位于氨基酸序列的同一位置(第19至197个氨基酸)，表明它们具有相似的功能。

图4 不同来源的EBP1氨基酸序列多重比对 注: 方框内序列编码PA2G4功能域 Figure 4 Multiple alignment of NfEBP1, StEBP1 and AmEBP1 Note: The sequences in the box encode PA2G4 functional domain

1.4 NfEBP1在青天葵不同组织中的qRT-PCR分析
引物qNBO-F/qNBO-F和qBeta-F/qBeta-R的普通PCR扩增均获得了与预期大小一致的目的基因NfEBP1和内参基因β-tublin的单一产物，表明引物具有特异性，可用于后续qRT-PCR分析。目的基因NfEBP1及内参基因β-tublin标准曲线如图5所示，在检测的6个数量梯度范围内，Ct值和起始模板稀释数的相关性良好。内参基因和目的基因的扩增效率E均在90%~105%范围内；得到的熔解曲线为单一峰值，引物特异性好，扩增产物单一，无引物二聚体或非特异性扩增，扩增效率满足比较Ct值法计算相对表达量的条件。

图5 标准曲线和熔解曲线 注: 目的基因扩增效率E＝90.6%; 相关系数R2＝0.995; y＝3.559x+30.102; 内参基因扩增效率E=90.1%, 相关系数R2=0.999, y=3.586x+33.994 Figure 5 Standard curves and melting curves Note: Amplification efficiency of target gene is 90.6%, association coefficient R2 reaches 0.995, y=3.559x+30.102; Amplification efficiency of reference gene is 90.1%, association coefficient R2 reaches 0.999, y=3.586x+33.994

以NfEBP1在叶柄中的表达量为对照组，计算叶片、球茎相对于叶柄的表达量。结果表明，NfEBP1基因在青天葵不同组织部位均有表达，而且相对表达量存在差异，其中在叶片的表达水平最高，其次为球茎，叶柄则最低(图6)。

图6 NfEBP1在青天葵不同组织的相对表达量 Figure 6 Relative expressional levels of NfEBP1 in different tissues from N. fordii

2讨论
Horiguchi等(2006)通过对叶子大小异常的拟南芥突变种的观察发现了叶子发育过程中细胞的增殖和扩张存在着一个器官内部的相互协调关系。目前，植物器官大小调控研究主要集中于寻找参与该调控机制的或与其相关的一些基因，并试图阐明它们的功能和作用机制。EBP1蛋白因植物生长素的存在而稳定，它是细胞分裂周期相关基因周期素cyclin D3;1、核苷酸还原酶2和周期素依赖性蛋白激酶B1;1表达的必需因子。过量表达或缺失EBP1可以促进或限制植物细胞的增殖和器官的增大。EBP1的作用因细胞所处的阶段而不同，在器官发育早期影响分生组织的分生能力，促进细胞增殖；在有丝分裂后期则作用于细胞扩张，增大细胞体积(Horváth et al., 2006; 黄琼林等, 2012)。另外过表达EBP1基因还可以增强植物抗冻能力(Cao et al., 2009)。目前已从沙冬青和土豆中克隆鉴定了植物EBP1基因(Horváth et al., 2006; Cao et al., 2009)。

本研究首次以药用植物为对象，在青天葵中对EBP1基因进行克隆，并采用生物学信息分析和同源基因比对证实NfEBP1基因是青天葵器官大小调控因子—表皮生长因子受体3结合蛋白的编码基因。生物信息学分析和预测对NfEBP1编码蛋白的表达纯化具有指示性作用，NfEBP1为位于细胞质中的非跨膜蛋白，并且为亲水性蛋白，经诱导剂和细胞裂解液处理后分布在上清液中，相比位于沉淀中复合包涵体蛋白更易于分离纯化。其他预测信息也有助于Nf- EBP1的功能鉴定和结构研究。另外，本研究首次以转录组为手段，有效地挖掘青天葵器官生长等相关生理功能基因序列，这一模式也可为其他岭南药用植物的基因克隆及其功能研究提供一种新的研究思路。

EBP1普遍在所有组织和细胞表达，在发育器官中的基因表达量最高(Horváth et al., 2006)。AmEBP1在沙冬青叶片的表达量均高于其在根、茎的表达量(Cao et al., 2009)。本研究表明，NfEBP1基因在青天葵的所有3个组织中均有表达，并以在叶片中的表达最高。青天葵以叶片或全株入药，且叶片占据其体积的较大比例，因此，NfEBP1在青天葵叶片中的表达高于其他组织这一趋势对通过基因工程调控青天葵叶片等器官大小有着一定的指导意义。

本研究成功克隆获得了青天葵EBP1基因，并分析其在青天葵不同组织的表达水平，为进一步鉴定该基因在调控器官大小方面的功能奠定基础，为利用该基因促进青天葵叶片等器官生长，提高青天葵产量提供基础数据。

3材料与方法
3.1植物材料 
青天葵引种于广西自治区天峨县、马山县，在本实验室栽培，经广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心詹若挺研究员鉴定为毛唇芋兰Nervilia fordii (Hance) Schltr.。

3.2总RNA的提取和cDNA的合成
按照植物RNA提取试剂盒(普利莱, 北京)说明书的步骤提取青天葵叶片总RNA；参照SMARTer RACE cDNA Amplication Kit (Clontech, 美国)说明书的方法合成5'和3' RACE Ready cDNA，用于基因克隆。

使用RNAiso Plus试剂(Takara, 日本)提取青天葵不同部位(叶片, 叶柄和球茎)总RNA，并用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) Kit合成cDNA，用于基因qRT-PCR分析。

3.3序列筛选和引物设计
作者在前期研究中通过RNA-seq高通量测序技术建立起生长旺盛期青天葵叶片和球茎转录组Unigene数据库，并在非冗余注释数据库(non-redundant database, Nr)、蛋白质直系同源簇数据库(cluster of orthologous groups, COG)、基因本体数据库(gene ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of gene and genomes, KEGG)进行BLAST比对注释，在获得注释的Unigene数据库中以“proliferation associated 2G4”为检索词，查找编码EBP1基因的Unigene序列。

根据搜索获得的Unigene序列，结合RACEPCR和qPCR引物设计要求，设计本研究所用的引物(表1)，由北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司合成。

表1 青天葵NfEBP1克隆和表达所用的引物 Table 1 Primers used for cloning and expression of NfEBP1

3.4 NfEBP1的克隆与分析
3.4.1 RACE-PCR扩增 
以UPM/NB51为引物进行5'RACE，扩增条件为：94℃预变性120 s；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃ 300 s。

以R3P1/NB31为引物进行3'RACE第一轮PCR，扩增条件为：94℃预变性120 s；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃ 300 s。以第一轮PCR的产物为模板，R3P2/NB32为引物进行3'RACE第二轮PCR，扩增条件为：94℃预变性120 s；94℃ 30 s，63.5℃ 30 s，72℃ 80 s，35个循环；72℃ 300 s。

RACE-PCR扩增目的片段T-A克隆至pGEM-T载体(Promega, 美国)，热击转化至E. coli Top10，以经PCR检测的阳性菌液用载体通用引物测序。

3.4.2 cDNA全序列的拼接及编码区的克隆
利用NCBI的“Blast 2 Sequence”功能，将3'端和5'端序列与数据库中该基因EST片段进行比对拼接，获得cDNA全长序列。用Omiga 2.0软件分析其开放阅读框(open reading fragment, ORF)，并翻译成氨基酸序列。将获得的氨基酸序列进行BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)检索，初步确认获得的蛋白是否相应基因的编码蛋白及其完整性。根据cDNA序列设计扩增NfEBP1编码区的特异性引物NBOF/NBOR，PCR克隆NfEBP1编码区，产物回收纯化后克隆至pGEM-T载体，筛选阳性克隆进行测序。

3.4.3目的基因的序列分析和比对
采用ProtParam在线工具(http://web.expasy.org/ protparam/)计算目的基因编码蛋白的分子量、等电点等理化性质(Gasteiger et al., 2003)；应用ProtScale在线工具(http://web.expasy.org/protscale/)预测蛋白质的亲水性/疏水性(Kyce and Doolittle, 1982)；蛋白质的二级结构预测通过SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html/)完成(Geourjon and Deléage, 1995)；采用iPSORT运算法则(http://hc.ims.u-tokyo.ac.jp/iPSORT/)对蛋白进行亚细胞定位预测(Bannai et al., 2002)。应用TMHMM Server v. 2.0在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/)预测蛋白质的跨膜结构域(Krogh et al., 2001)。利用NCBI的BLASTP程序对氨基酸序列进行同源检索和功能域在线预测，并采用DNAMAN软件进行多重比对。

3.5 NfEBP1的 qRT-PCR分析
3.5.1普通PCR扩增
以β-tublin为NfEBP1在青天葵不同组织中荧光定量PCR分析的内参基因，分别以引物qNBO-F/ qNBO-F和qBeta-F/qBeta-R扩增目的基因和内参基因。先以普通PCR扩增效果初步验证两引物的可行性，以PCR产物为与预期大小一致的单一条带为准。PCR反应体系总体积为25 μL，其中Premix Ex Taq 12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各0.5 μL、cDNA适量、灭菌蒸馏水补足体积。反应程序为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，52℃~58℃退火30 s，72℃延伸30 s，32个循环；72℃延伸5 min。用4.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

3.5.2 qRT-PCR扩增
取10 μL稀释1 000倍的普通PCR产物和10 μL青天葵cDNA的混合样品作为起始模板，将起始模板进行10倍梯度稀释，共6个浓度梯度作为模板进行qRT-PCR, 评价引物的扩增效率以及建立标准曲线反应体系(20 μL)为：SsoAdvanced SYBRGreen Supermix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，相应浓度梯度的混合模板0.5 μL，灭菌水补足体积。扩增条件为：95℃ 30 s；95℃ 3 s，55.4℃/58.1℃ 3 s，40个循环，扩增完毕后进行55℃~95℃熔解曲线分析。

按照上述获得的标准曲线和反应体系，分别以青天葵3个组织的cDNA为模板进行β-tublin和NfEBP1基因的qRT-PCR扩增，每个组织各设立3个生物学重复和技术重复。

3.5.3数据分析
以叶柄NfEBP1为对照组目的基因，采用比较Ct值法计算目的基因相对表达量F，公式为F=2^-△△Ct，其中△△Ct=(待测组目的基因Ct值-待测组内参基因Ct值)-(对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值)。

作者贡献
黄琼林是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成基因克隆，数据分析和论文初稿的写作；梁凌玲参与实验设计，完成基因定量PCR分析；詹若挺完成植物鉴定；何瑞和陈蔚文是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
感谢广西中医药研究院黄云峰老师大力帮助样品收集。

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