植物蜡粉，又名蜡质、蜡被，是对覆盖于裸露在空气中的植物组织的表皮脂质成份的一个集体称呼，还包括地下的木栓质基质、愈伤组织、花粉粒以及种皮中的脂类(Kunst and Samuels, 2003)。它是覆盖在植物表皮细胞外的一层由亲脂性化合物构成的疏水层，一般呈绿灰色、灰白色霜状。表皮的蜡粉主要由特长链饱和脂肪酸(very long chain fatty acids, VLCFAs)的衍生物组成，如：烃(Alkanes)、醛(Aldehydes)、酮(Ketones)、一级醇(Primary alcohols)、酯(Esters)、二级醇(Secondary alcohols)等(Millar et al., 1999; Jenks et al., 2002)。在植物生长发育过程中，蜡粉的主要作用是减少非气孔的蒸腾作用(Riederer and Schreiber, 2001; Ristic and Jenks, 2002; Oliveira et al., 2003)，保护植物免受外来的机械损伤(Jenks et al., 2002; Mariani and Wolters-Arts, 2000)、病虫害入侵(Markst?覿dter et al., 2000; Müller, 2006)、太阳辐射(Holmes and Keiller, 2002)等。

蜡粉缺失突变体已经在大麦(Hordeumvulgare)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)和油菜(Brassica napus)等许多植物种类中有所报道。在大麦和拟南芥上的突变位点被称为eceriferum (cer)，而在玉米和油菜上的突变位点被称为glossy。大麦是研究最广泛的物种，已经确定了85个cer突变位点(von Wettstein and Chua, 1987)。拟南芥已经筛选出120多个上表皮层突变体，代表32个突变位点(Jenks et al., 2002)。

通过突变体，目前已经克隆了一些参与蜡质合成及调控的相关基因。例如在蜡粉成分的传输过程中编码与蜡粉合成相关的酶或蛋白的基因：CER1、CER2、CER6/CUT1、KCS1、FIDDLEHEAD (FDH)和WAX2 (Aarts et al., 1995; Xia et al., 1997; Fiebig et al., 2000; Todd et al., 1999; Pruitt et al., 2000; Chen et al., 2003)，编码调控蛋白的基因：CER3、GL2、GL15和WIN1/SHN1 (Hannoufa et al., 1996; Tacke et al., 1995; Moose and Sisco, 1996; Kannangara et al., 2007)。

本研究通过对大白菜花茎蜡粉性状的遗传分析，利用F₂代无蜡粉隐性纯合个体对蜡粉基因进行初步定位，开发与蜡粉基因紧密连锁的SSR标记，为下一步的精细定位和基因克隆奠定基础。

1结果与分析
1.1大白菜花茎蜡粉性状的遗传分析
将有蜡粉和无蜡粉的亲本自交、正反交后，自交后代均各自表现出与亲本相同的表型性状，正反交F₁植株的花茎均有蜡粉(表1)。在BC₁回交世代中，与有蜡粉亲本回交的材料均表现为有蜡粉表型，而与无蜡粉亲本回交的材料则出现有无蜡粉的性状分离，且分离比符合1:1的理论比值(χ²=1.45< χ²_0.05=3.84)。在F₂世代，有无蜡粉植株的分离符合3:1的理论值(χ²=1.85<χ²_0.05=3.84)。以上结果说明大白菜花茎有无蜡粉是一对质量性状，受一对核等位基因控制，且有蜡粉对无蜡粉表现为完全显性。

表1 大白菜蜡粉性状在亲本及各世代中的遗传分析 Table 1 Genetic analysis of parental lines and crosses between waxy and glossy trait in Chinese cabbage

1.2多态性SSR标记的筛选
从供试的186对SSR引物中，筛选出亲本间具有多态性的SSR标记107个，多态性比例达到57.5%。利用20个F₂无蜡粉表型单株对筛选出的107个标记进行验证，结果表明位于A01连锁群上的nia-m086a标记可能与蜡粉基因连锁。为了进一步证明nia-m086a与蜡粉基因是否紧密连锁，将nia-m086a在两个亲本和308株F₂无蜡粉单株间分别进行扩增(图1)，结果显示，在308株F₂无蜡粉单株中有20株发生重组，重组率为3.25%。

图1 部分F2群体的nia-m086a分析结果 注: P1: 08A161; A: F2分离群体中的有蜡粉单株; B: F2分离群体中的无蜡粉单株; *: 重组个体 Figure 1 SSR analysis with nia-m086a on part of F2 plants Note: P1:08A161; A: The waxy individuals of F2 plants; B: The glossy individuals of F2 plants; *: Recombinant individuals

为筛选与蜡粉基因紧密连锁的标记，我们在nia-m086a附近区域设计引物，其中24对SSR引物在亲本间有多态性，通过20个F₂隐性纯合单株的验证，11个SSR标记与蜡粉基因紧密连锁，分别为SSRzx46、SSRzx45、SSRzx54、SSRzx32、SSRzx55、SS-Rzx36、SSRzx39、SSRzx15、SSRzx24、SSRzx22和SSRzx25 (表2)。

表2 SSR引物序列及重组单株情况 Table 2 Sequences of SSR marker primers and the number of the recombinant individuals

1.3蜡粉基因的初步定位
将筛选出的11对SSR引物和nia-m086a分别扩增308个F₂隐性个体，结果表明，SSRzx46和SSRzx45的重组单株不同于SSRzx54、SSRzx32、SSRzx55、SSRzx36、SSRzx39、SSRzx15、SSRzx24、SSRzx22和SSRzx25，并且SSRzx46、SSRzx45与nia-m086a的重组单株相同，位于基因的同一侧，而另外9个标记位于基因的另一侧。根据重组单株的株数(表2)可判断蜡粉基因在SSRzx45和SSRzx54这两个标记之间，遗传距离分别为1.54 cM和0.56 cM。应用JoinMap3.0软件绘制大白菜花茎蜡粉基因的标记连锁图谱(图2)。

图2 大白菜花茎蜡粉基因的标记连锁图 注: 图谱左端为遗传距离; 右端为连锁标记 Figure 2 A linkage map of wax gene in Chinese cabbage Note: The genetic distance are listed the left side; The markers are listed the right side

2讨论
 蜡粉性状在十字花芸薹属作物上是广泛存在的。本研究结果表明大白菜有无蜡粉性状受一对核基因控制，属于质量遗传，这与赵建锋等(2006)在菜薹和曹阳等(2008)在小白菜中所得出的结果一致。黎炎等(2005)在对节瓜果皮蜡粉遗传的研究中也初步探明了节瓜老熟瓜果皮蜡粉的遗传属于质量性状遗传，受一对核基因控制，有蜡粉对无蜡粉表现为显性。

SSR标记具有重复性好、多态性高、呈共显性遗传和数量丰富等特点，因此广泛应用于连锁图谱的构建和基因定位。本研究以nia-m086a作为锚定标记，将蜡粉基因定位于A01连锁群上，在此基础上，我们根据Brassica database (BRAD) (http://brassicadb.org/brad/index.php/)确定nia-m086a在连锁群上的位置，开发出11个与蜡粉基因紧密连锁的标记，将蜡粉基因初步定位在SSRzx45与SSRzx54这两个标记之间(图2)。

与蜡粉的合成与调控相关的基因在拟南芥中已经通过突变体的方法找到很多，但在芸薹属作物中还没有相关研究。刘富中和Gostimskii (1999)用易位系将豌豆的无蜡粉突变基因w-2定位到豌豆的第7染色体短臂上。本研究通过标记定位基因的方法将蜡粉基因初步定位在A01连锁群上，在寻找与蜡粉合成与调控相关基因的道路上是一种新的尝试。获得的SSRzx45和SSRzx54两个标记与蜡粉基因紧密连锁，我们将继续开发更近的标记，促进蜡粉基因的克隆研究。

3材料与方法
3.1试验材料
选择有蜡粉的自交系08A161作为母本和无蜡粉的自交系08A235-2作为父本，对两个品种进行自交、杂交，得到的F₁代分别与父母本进行回交，得到BC₁，F₁代自交获得F₂代。所有世代材料种植于沈阳农业大学蔬菜遗传育种试验基地，田间统一管理，待植株抽薹后调查花茎上有无蜡粉情况，应用χ²适合性测验，对蜡粉性状进行遗传分析。

3.2 DNA的提取和PCR扩增
选取两个亲本和308株F₂的隐性纯合无蜡粉个体的幼嫩叶片，采用Murray和Thompson (1980)的CTAB法略作修改，提取基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度，将纯化后的DNA稀释至50 ng/μL备用。

SSR扩增体系总体积10 μL，包括50 ng模板DNA、0.5 μmol/L上下游引物各1 μL、10× Taq Reaction Buffer (包含Mg²⁺) 1.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，1 U Taq。PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s，30个循环；72℃再延伸10 min。扩增产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，AgNO₃染色观察条带。

3.3 SSR标记筛选、数据统计及连锁图构建
用于两个亲本SSR引物多态性筛选的SSR引物来自芸薹属基因组测序计划(BrGSP)，尽可能在大白菜A基因组的每个连锁群上均匀的选取SSR引物，共186对。使用SSRHunter和Primer Premier 5.0在目标区域进一步设计引物，以其找到与蜡粉基因紧密连锁的标记。

利用筛选出的标记对F₂群体进行验证，统计条带的分离情况。与无蜡粉带型相同的个体基因型记为A，重组的带型记为H。利用JoinMap3.0软件分析SSR标记与Wax基因的连锁关系，并以最小LOD阈值3.0和最大重组率值0.4构建遗传图谱。Kosambi函数用于计算遗传图距，最终获得蜡粉基因的SSR连锁图。

作者贡献
张曦、刘志勇和冯辉是本研究的实验设计和实验研究的执行人；张曦和王秋实完成数据分析，论文初稿的写作；邹春蕾、王一衡参与实验设计，试验结果分析；冯辉是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(31272157; 31201625)资助。作者感谢辽宁省农业科学院植物保护研究所王平先生在本研究过程中给予的帮助。

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