光萼荷属(Aechmea)系凤梨科(Bromeliaceae)凤梨亚科(Bromelioideae)，约有250余种，主要分布于中、南美洲的热带雨林地区，大部分为附生植物。据美国弗罗里达州凤梨协会统计，目前光萼荷属约有近500个品种。由于光萼荷属具有奇特的圆锥状、穗状或肉穗状花序，花色艳丽，观赏价值很高，目前已经成为观赏凤梨的重要栽培类群之一。

SSR标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，该标记具有信息量高、特异性好、共显性等优点，已经成为植物育种研究中最重要的分子标记之一，并广泛应用于杂种鉴定(张红莲等, 2010; 王同华等, 2012; 付小琼和叶武威, 2012)、指纹图谱构建(王晶等, 2012; 张飞等, 2012)、种质资源评价(赵岩等, 2010)和遗传作图(Carlier et al., 2012)等研究。在凤梨科植物中，已知仅在凤梨属(Kinsuat and Kumar, 2007; Carlier et al., 2012)、丽穗凤梨属(Palma-Silva et al., 2007)、铁兰属(Boneh et al., 2003)、艳红凤梨属(Sarthou et al., 2003; Paggi et al., 2008)和帝王凤梨属(Palma-Silva et al., 2007)等属中开发出SSR标记。在光萼荷属观赏凤梨中，可用的分子标记仅限于AFLP (Zhang et al., 2012a)、ISSR (Zhang et al., 2012b)、SRAP (Wang et al., 2012; Zhang et al., 2012c)等，鲜见SSR标记的报道(张飞等, 2012)。

为了进一步拓展光萼荷属观赏凤梨中可用分子标记种类，本研究拟根据凤梨科其他属中已经开发的SSR标记引物，研究不同属SSR标记引物在光萼荷属观赏凤梨中的通用性，筛选有效SSR标记引物，为今后光萼荷属观赏凤梨资源评价、遗传图谱构建等研究提供新的手段。

1结果与分析
1.1光萼荷属植物叶片基因组DNA质量检测
 利用改良的CTAB法提取光萼荷属植物A050和A064及其40份F₁单株的基因组总DNA，通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测图谱(图1)可以看出，所提取的基因组总DNA主带清晰可辨，质量较好，可以进行下一步PCR试验。

图1 部分光萼荷属植物基因组总DNA的电泳图谱 注: 1: 光萼荷属植物A050; 2: 光萼荷属植物A064; 3~20: 部分F1杂交后代 Figure 1 Electrophoresis profiles of genomic DNA of some Aechmea species Note: 1: Aechmea species A050; 2: Aechmea species A064; 3~20: Samples of the F1 hybrid individuals

1.2 SSR标记的通用性
通过对84对SSR标记引物进行PCR扩增，结果有68对引物能够在光萼荷属植物中扩增出清晰稳定的带型，通用性比例达81.0% (表1)。其中来自凤梨属、丽穗凤梨属、铁兰属、艳红凤梨属和帝王凤梨属的SSR标记引物在光萼荷属植物中的有效扩增比例分别为80.7%、72.7%、80.0%、100.0%和75.0% (表1)。因此，通用性高低顺序依次为：艳红凤梨属、凤梨属、铁兰属、帝王凤梨属和丽穗凤梨属。部分电泳检测结果见图2。

表1 凤梨科不同属SSR标记引物在光萼荷属植物中的扩增结果 Table 1 Amplification results of SSR markers developed from different species of Bromeliaceae on Aechmea species

图2 不同SSR标记引物在光萼荷属植物A050和A064中的扩增结果 注: M: DL600 marker; 1~22: 不同SSR标记引物对 Figure 2 Banding patterns of different SSR primer pairs amplified on Aechmea species A050 and A064 Note: M: DL600 marker; 1~22: Different SSR primer pairs

1.3 SSR标记在光萼荷属植物杂种鉴定中的应用
为进一步检测SSR标记引物的稳定性，利用部分通用性较好的铁兰属SSR标记引物e6和p2p19对部分光萼荷属植物A050 (母本)和A064 (父本)的F₁杂交群体进行杂种鉴定。当F₁单株扩增产物中具有父本特异条带即可鉴定为真杂种，若仅具有母本特异条带，则需要结合其他引物进一步分析。研究结果显示，在SSR标记引物e6的扩增图谱中，有24个F₁单株具有父本A064的特异条带，可以鉴定为真杂种(图3A)；在SSR标记引物p2p19的扩增图谱中，父本A064的特异条带较多，且鉴定其余16个F₁单株也为真杂种(图3B)。因此，通用性SSR标记引物可以用于光萼荷属植物的杂种鉴定研究。

图3 SSR标记e6 (A)和p2p19 (B)在光萼荷属植物A050和A064及其F1杂交后代中扩增带型 注: M: DL600 marker; a: 光萼荷属植物A050; b: 光萼荷属植物A064; 箭头所指为特异条带 Figure 3 Banding patterns of SSR markers e6 (A) and p2p19 (B) amplified on Aechmea species A050 and A064 and their F1 hybrid progeny Note: M: DL600 marker; a: Aechmea species A050; b: Aechmea species A064; The arrows indicate the polymorphic bands specific to male parent A064

2讨论
SSR标记引物的开发主要有3种途径：一是直接从植物基因组文库中分离出SSR标记引物(Tang et al., 2010)，该类方法代价高昂，效率较低；另一种比较低廉、高效的方法是从大量EST (expressed sequence tags)和其他DNA序列中分离SSR标记引物(Heesacker et al., 2008; Tsuda et al., 2009)。然而，EST-SSR标记的开发仅局限于已经建立序列数据库的植物，对尚无构建序列数据的植物来说，SSR标记引物的开发也是比较昂贵的，耗时也比较长。对于这类植物来说，利用其近缘物种中现有的SSR标记引物开发适用于该种植物的通用性SSR标记引物是比较廉价且应用范围较广的研究手段(Sharma et al., 2009; Mnejja et al., 2010; 赵岩等, 2010)。

关于SSR标记引物的通用性分析在凤梨科植物中也有相关报道。Boneh等(2003)研究发现Tillandsia fasciculate的SSR标记引物在Guzmania nonostachya中的通用性为60%；Paggi等(2008)分析了从Pitcairnia albiflos中开发出8对SSR标记引物在其他16份凤梨科植物资源中的通用性，发现有4对(50%)具有较好的通用性。本研究中，在凤梨科凤梨属、丽穗凤梨属、铁兰属、艳红凤梨属和帝王凤梨属等5个属的84对SSR标记引物中，有68对SSR标记引物在光萼荷属植物中的扩增效果较好，通用性高达81%。有研究显示，不同科、属间SSR标记引物的通用性也因物种的不同而变化(Gasic et al., 2009; 赵岩等, 2010)。本研究中，凤梨属、丽穗凤梨属、铁兰属、艳红凤梨属和帝王凤梨属中的SSR标记引物在光萼荷属植物中的通用性比例在72.7%~100.0%之间。因此，从近缘物种已有的SSR标记引物中开发适合光萼荷属植物的通用性SSR标记引物是可行的。

然而，通过通用性SSR标记引物筛选和杂种鉴定研究发现，本研究中的通用性SSR标记引物多态性很高，但是特异性较低，且没有反映出SSR标记的共显性特征，这可能是由于不同物种之间具有不同的基因组结构造成的。尽管如此，这些通用性SSR标记引物为光萼荷属植物杂种鉴定、种质资源评价和连锁遗传图谱构建等研究提供了新的技术手段。另一方面，有必要通过基因组测序开发光萼荷属植物自有的SSR标记引物，提高SSR引物特异性，充分发挥SSR标记在分子标记辅助育种中的优势。

3材料与方法
3.1试验材料
试验材料为保存于浙江省农业科学院花卉研究开发中心观赏凤梨种质资源圃中的光萼荷属植物A050 (A. gomosepala)、A064 (A. recurvata var. recurvata)，及其40份杂交后代。

3.2基因组总DNA提取与检测
采用CTAB法(Murray and Thompson, 1980)提取上述光萼荷属植物的基因组总DNA，并利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

3.3 SSR引物
本研究共包括84对SSR或EST-SSR引物，由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成。其中，来自凤梨属(Kinsuat and Kumar, 2007; Carlier et al., 2012)、丽穗凤梨属(Palma-Silva et al., 2007)、铁兰属(Boneh et al., 2003)、艳红凤梨属(Sarthou et al., 2003; Paggi et al., 2008)和帝王凤梨属(Palma-Silva et al., 2007)的SSR标记引物分别为57、11、5、7和4对。

3.4 PCR扩增及电泳检测
PCR反应体系为10 μL，包括10×Buffer 1.0 μL、25 mmol/L MgCl₂ 0.8 μL、2.5 mmol/L dNTP 0.4 μL、5 U Taq聚合酶0.1 μL、5.0 μmol/L引物1.0 μL、50 ng DNA模板，其余部分用ddH₂O补充。反应程序参考Palma-Silva等(2007)程序，并作适当改动，具体为：95℃预变性3 min；94℃变性30 s，48℃~58℃复性30 s，72℃延伸30 s，10个循环；94℃变性30 s，48℃复性30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用8.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，拍照保存。

3.5 SSR标记引物的通用性分析
以光萼荷属植物A050和A064的基因组DNA为模板，分别对84对SSR引物进行PCR扩增，根据扩增带的效果筛选有效通用性SSR引物，并利用杂交群体检测其稳定性。

作者贡献
王炜勇和张飞是本研究的实验设计和实验研究的执行人，并完成论文初稿的写作；俞少华、沈晓岚、葛亚英和郁永明参与实验设计，试验结果分析；俞信英、张智和沈晓岚参与杂交组合的配置；张飞和郁永明负责对论文的修改；王炜勇、张飞和郁永明是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(31101570)、浙江省自然科学基金(Y3110271)、浙江省十二五花卉新品种选育协作攻关项目(2012C12909-17)、浙江省公益性技术应用研究计划(2011C22014)、浙江省重点科技创新团队项目(2011R50034-14)、杭州市科技计划项目(20110332H15, 20120232B41)和浙江省农业科学院创新能力提升工程项目(2011R25Y01D01)共同资助。

参考文献
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