SSR (Simple sequence repeat)简单重复序列，通常又称为微卫星或者STMS (sequence-tagged microsatellites)被认为是研究植物群体遗传变异最好的标记方法之一，己广泛应用于种质资源鉴定、遗传连锁图谱绘制、标记性状基因定位等研究中(Zhebentyayeva et al., 2003)。

开展SSR实验，首先要摸索实验条件，优化实验体系。其方法主要有：(1)对体系各成分进行梯度实验确定最佳组合(刘晓丽等, 2007; 石磊等, 2007; 张文娜等, 2009)；(2)建立正交实验，从电泳图直接选出合适组合(韩晓雨等, 2011)；(3)建立正交实验对电泳结果人为评分，进行方差分析计算最佳组合(郭旭琴等, 2012; 孙雯雯等, 2011)；(4)建立正交实验，确定各成分浓度范围，再进行梯度实验(谢文刚等, 2008; 周静等, 2011; 李亚利等, 2008)。对正交实验电泳结果人工评分，再进行方差分析选出最优组合是SSR体系优化普遍做法。人工评分在判定最佳带型和最差带型时比较准确，而对其他带型地评判就会出现较大偏差。

本研究对正交实验后的评分方法进行改良，用PHOTOSHOP对正交实验电泳图进行分析得到像素数据，再转化为数字数据，计算最佳组合。

1结果与分析
1.1正交实验SSR电泳带谱实例
体系优化电泳结果如图1，各泳道带谱颜色深浅和杂带数量差异显著，说明正交实验各水平设计合理，可以进行后续分析。

图1 正交实验电泳图 Figure 1 Electrophoresis banding profile generated by the orthogonal experiments

1.2 SSR电泳带谱数据转换与分析
1.2.1数据转换
研究何正文的直观分析方法(何正文等, 2008)，分析出该原理是依靠肉眼辨别主带对比度，可用Photoshop软件来实现对比度识别。在Photoshop中平均值就是平均亮度值(Adobe, 2012, http://help.adobe.com/zh_CN/photoshop/cs/using/WSfd1234e1c4b69f30ea53e41001031ab64-768da.html)，对比度为图像亮暗差异，主带区域为暗区，主带间空白区域为亮区，其差值可以代表主带对比度，参照公式：差值＝主带间空白部分平均值－(第一主带平均值+第二主带平均值)/2。

1.2.2数据评分
参考何正文的方法对差值最高和最低的泳道进行评分，再按照下面公式计算出各泳道分数(默认差值和得分是一次函数关系)。杂带评分时平均值即为差值，后续计算方法不变(注意: 对于缺带的泳道, 主带, 杂带评分为0)。
  
本次试验(图1)主带满分10分，杂带满分10分，总分20分。主带差值最高的为第15泳道，最低的为第4泳道，但第4泳道缺带，第14泳道为差值最低泳道，分别给予10分和1分。杂带差值高的为第4泳道，但主带缺带给予0分，第5泳道晋升为差值最高泳道，第13泳道为差值最低泳道，分别给予9分和0分。结果见表1。

表1 Photoshop辅助分析结果 Table 1 The result of Photoshop-added analysis

1.2.3数据分析
根据最后得分计算极差和每一因素水平的均值(表2)。极差反应各因素对体系的影响大小，极差越大越显著，从结果看出Mg²⁺>dNTPs>DNA聚合酶>引物。水平因素的均值反应该水平影响程度，从表2看出最优组合为Taq酶0.75 U，DNTP0.3 mmol/L，Mg 1.0 mmol/L，引物0.6 μmol/L。

表2 正交实验设计及结果(L16 (45)) Table 2 The orthogonal experimental design and result (L16 (45))

1.3验证实验
对所得最优组合进行验证实验，用21个月季品种进行SSR实验，所得电泳图清晰(图2)，说明用Photoshop辅助评分是可行的，科学的方法。

图2 21个月季品种电泳图 Figure 2 Electrophoretic ananlysis of 21 rose cultivars

2讨论
直观分析法是以肉眼对电泳图对比度地判断为基准，解决了当时PCR体系优化的难题，后来多为科研工作者应用于体系优化。这就导致直观分析法容易加入过多的人为因素，且应用中评分设置不明，在正交实验处理较多或有重复实验的时候，优化实验会出现更大的偏差。

Photoshop分析法是基于软件分析图像对比度，运用该软件可得到主带、杂带区域的平均值差值，也就是对比度值。然后进行差值的赋值，利用直观分析法对最优、最差带型评分较准确的特定，对差值最高、最低的泳道进行评分，以此确定差值和得分一次函数方程，并计算其他泳道得分。

本研究发明、验证的方法去除了大量的人为因素干扰，完成了从图像到评分的转换，能保证最后得分的准确，可以精确的计算出最优组合。本文介绍了该方法在SSR体系优化中的应用，对于条带较少的电泳结果，可以应用本方法。对于条带较多的其他分子标记方式可以框选整个主带区域，直接参考Photoshop信息窗口中的标准偏差一项，作为组后得分的判定标准。另外本方法原理可以应用于相关软件的开发。

3材料和方法
3.1材料
品种：21个月季(Rosa hybrida L.)品种，均于2012年6月采自河北农业大学月季资源圃，反应体系实验以月季品种‘红双喜’为实验材料，以1‘廷沃尔特’，2‘红双喜’，3‘马希纳’，4‘里程碑’，5‘现代艺术’，6‘蓝丝带’，7‘蓝宝石’，8‘美多期’，9‘古龙’，10‘大紫光’，11‘粉和平’，12‘优雅’，13‘金背大红’，14‘摩洛科公主’，15‘电子表’，16‘金奖章’，17‘微笑’，18‘百老汇’，19‘外交家’，20‘赞歌’，21‘御用马车’为验证实验材料。

试剂：实验所用引物RH80，送往生工生物工程(上海)有限公司合成。DNA聚合酶、dNTPs及Mg²⁺等其他试剂购自宝生物技术有限公司。
软件：PhotoshopCS5，由美国Adobe Systems公司开发和发行。

3.2基因组DNA提取
采用改良CTAB法(李先进等, 2008)，提取DNA。

3.3正交方案设计
选用L16(45)正交表，第一因素为DNA聚合酶，第二因素dNTPs，第三因素Mg²⁺，第四因素引物，每个因素设置4个水平(表2)。DNA稀释到10 ng/μL每个体系加1.5 μL，Buffer加1.0 μL,其余的去离子水补齐，建立10 μL反应体系。

3.4 PCR反应条件及电泳
扩增程序：95℃ 5 min，94℃ 40 s，50℃ 50 s，72℃ 60 s，30个循环，72℃ 8 min。PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶在JY-ECP3000电泳仪上进行电泳，200 V 40 min，取出胶片用AgNO₃染色(0.1% AgNO₃)银染15 min；去离子水冲洗胶片一遍后，先用显色液(2% NaOH, 0.3%甲醛)润洗再用显色液显色，直至条带清晰为止，照相记录。

3.5 Photoshop分析电泳图像
在Photoshop中打开电泳图(彩图的要按Ctrl+Shift+Alt+B转换成黑白的图像)，首先按F8调出图像信息窗口，按Ctrl+J复制图层，然后隐藏原始图层，新建一个空白图层，最后用矩形选框工具框选泳道两条主带下面的一条主带，记录信息窗口中直方图面板显示的平均值。然后点击框选区域外不放,把选框拖移到下一泳道的对应主带并记录平均值。令下面的一条主带为第一主带，上面的主带为第二主带，每条主带、主带间空白部分及杂带区域依次进行上述操作。

作者贡献
杨旭是本研究的实验设计和实验研究的执行人；杨旭和杨艳丽完成数据分析，论文初稿的写作；杨林参与实验结果分析，论文修改和润色的工作；杨敏生是论文的负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由林业公益性行业科研专项(201104039)资助。

参考文献
Guo X.Q., You Q.F., Wang G.B., Cao F.L., Huang G.Y., Cang X.W., and Zhang X., 2012, Optimization for ISSR reaction system of ailanthus altissima by orthogonal design, Anhui Nongye Kexue (Journal of Anhui Agricultural University), 40(5): 2570-2573 (郭旭琴, 游庆方, 汪贵斌, 曹福亮, 黄广远, 仓湘斐, 章霞, 2012, 用正交设计法优化臭椿 SRAP-PCR反应体系, 安徽农业科学, 40(5): 2570-2573)

Han X.Y., Wang S.F., Wei Y.Y., Liu X.X., and Fu W.M., 2011, Establishment and optimization of EST-SSR system for radish, Shandong Nongye Kexue (Shandong Agricultural Sciences), 10: 1-3, 7 (韩晓雨, 王淑芬, 魏佑营, 刘贤娴, 付卫民, 2011, 萝卜EST-SSR反应体系的建立与优化, 山东农业科学, 10: 1-3, 7)

He Z.W., Liu Y.S., Chen L.H., Cao M.H., and Xia Jiahui, 1998, Orthogonal design-direct analysis for PCR optimization, Hunan Yike Daxue Xuebao (Bulletin of Hunan Medical University), 23(4): 403-404 (何正文, 刘运生, 陈立华, 曹美鸿, 夏家辉, 1998, 正交设计直观分析法优化PCR条件, 湖南医科大学学报, 23(4): 403-404)

Li X.J., Peng Z.S., Zhang Z.Y., and Ruan Q.P., 2008, A study of different methods for DNA extraction from pteridophyte, Mianyang Shifan Xueyuan Xuebao (Journal of Mianyang Normal University), 27(8): 85-87 (李先进, 彭正松, 张正英, 阮期平, 2008, 四种药用蕨类DNA提取的比较研究, 绵阳师范学院学报, 27(8): 85-87)

Li Y.L., Chen S.X., Meng H.W., Cheng Z.H., and Chai D.D., 2008, Optimization of SSR-PCR system for cucumber using orthogonal design, Xibei Nongye Xuebao (Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica), 17(3): 280-284 (李亚利, 陈书霞, 孟焕文, 程智慧, 柴丹丹, 2008, 利用正交设计优化黄瓜的SSR-PCR反应体系, 西北农业学报, 17(3): 280-284)

Liu X.L., He T.M., Zhang M.Y., Zhang L.J., Ci Z.J., Zhang C.Y., and Chen X.S.. 2007, Optimization of SSR analysis system in walnut, Guoshu Xuebao (Journal of Fruit Science), 24(2): 140-145 (刘晓丽, 何天明, 张美勇, 张立杰, 慈志娟, 张春雨, 陈学森, 2007, 核桃SSR反应体系的优化, 果树学报, 24(2): 140-145)

Shi L., Li L., and Zheng X.Y., 2007, Optimization of SSR-PCR system for identification in Chinese cabbage (Brassica campestris L. ssp. Pekinensis), Fenzi zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 5(1): 110-116 (石磊, 李丽, 郑晓鹰, 2007, 大白菜 SSR 检测体系的优化, 分子植物育种, 5(1): 110-116)

Sun W.W., Sun J., Zhou J.Y., and Sun Q.B., 2011, Establishment of inter-simple sequence repeat (ISSR) reaction system and construction of fingerprint in Ziziphus jujuba genus, Anhui Nongye Daxue Xuebao (Journal of Anhui Agricultural University), 38(6): 940-945 (孙雯雯, 孙俊, 周军永, 孙其宝, 2011, 枣 ISSR 反应体系的建立及其指纹图谱构建, 安徽农业大学学报, 38(6): 940-945)

Xie W.G., Zhang X.Q., Peng Y., Ma X., and Zeng B., 2008, Optimization of SSR-PCR reaction system in dactylis glomerata and SSR primer selection, Fenzi zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 6(2): 381-386 (谢文刚, 张新全, 彭燕, 马啸, 曾兵, 2008, 鸭茅SSR-PCR反应体系优化及引物筛选, 分子植物育种, 6(2): 381-386)

Zhang W.N., Wang Y., Kong J., Li T.Z., Zhang X.Z., Han Z.H., and Xu X.F., 2009, Optimization of SSR system in sweet cherry cultivars, Shengwu Jishu Tongbao (Biotechnology Bulletin), 11: 103-107 (张文娜, 王忆, 孔瑾, 李天忠, 张新忠, 韩振海, 许雪峰, 2009, 甜樱桃品种SSR-PCR反应体系的优化, 生物技术通报, 11: 103-107)

Zhebentyayeva T.N., Reighard G.L., Gorina V.M., and Abbott A.G., 2003, Simple sequence repeat (SSR) analysis for assessment of genetic variability in apricot germplasm, Theor. Appl. Genet., 106(3): 435-444

Zhou J., Chen S.X., Cheng Z.H., and Meng H.W., 2011, Establishment and optimization of SSR reaction system in garlic, Xibei Nongye Xuebao (Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica), 20(11): 117-122 (周静, 陈书霞, 程智慧, 孟焕文, 2011, 大蒜SSR体系的建立与优化, 西北农业学报, 20(11): 117-122)