百合(Lilium spp.)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生球根花卉，除传统药用、食用及提取香精外，其花姿优美、清香晶莹、气度不凡的特性使其成为世界上最受欢迎的鲜切花之一，近几年栽培面积逐年增大，而东方百合(Lilium orienta)因其花色艳丽、芳香馥郁备受消费者青睐(屈云慧等, 2004)，‘Sorbonne’和‘Francia’是东方百合中著名的鲜切花品种(刘湘丹等, 2007)。

经离体和活体检测发现东方百合‘Sorbonne’对百合灰霉菌表现为高度抗病，而‘Francia’表现为高度感病(朱丽梅等, 2010)。以‘Sorbonne’为母本，‘Francia’为父本进行东方百合抗灰霉病育种，共获得767个杂种后代试管苗。为采用分子标记方法鉴定杂种的真实性，并开展东方百合灰霉病遗传规律研究，需要为杂种群体大量杂种后代基因组DNA的提取选择适宜的方法。

自Marmu建立用十二烷基磺酸钠(SDS)和氯仿从细胞中分离提取DNA样品的经典方法以来，研究者一直探索制备高纯度、高完整性DNA制品的最佳方案(Steiner et al., 1995; 李维平等, 2002; 应天玉等, 2003; 文传浩等, 2000, 云南大学学报(自然科学版), 22(5): 392-393)。百合由于多糖等次生代谢物质含量较高，其DNA提取和纯化难度较大，掌握最适的DNA提取方法是进行百合分子生物学研究的基础。

本研究以东方百合‘Sorbonne’בFrancia’杂种后代试管苗叶片为DNA提取材料，采用SDS-CTAB法、简易CTAB法、CTAB-高盐法、CTAB-硅珠法等4种方法，提取杂种后代试管苗叶片的基因组DNA，并对所提取DNA的耗时、纯度、得率、浓度和质量等指标进行对比，以筛选百合基因组DNA提取的适宜方法，为‘Sorbonne’בFrancia’杂种群体大量杂种后代试管苗叶片基因组DNA提取奠定基础。

1结果与分析
1.1 4种方法提取百合总DNA的比较
采用SDS-CTAB法、简易CTAB法、CTAB-高盐法、CTAB-硅珠法等4种方法提取百合杂种后代试管苗叶片的基因组DNA，除CTAB-硅珠法无法得到DNA外，其余3种方法均获得DNA，SDS-CTAB法耗时最多，平均耗时为4.4 h，简易CTAB法耗时最少，为3.1 h。

紫外分光光度计进行DNA纯度、浓度检测，结果显示，不同方法提取的杂种后代试管苗叶片总DNA在得率和质量上存在差异(表1)。在总DNA得率上，简易CTAB法最高，其次是CTAB-高盐法，SDS-CTAB法得率最低。当OD₂₆₀/OD₂₈₀的数值在1.8~2.0时，表示基本没有蛋白质、RNA的污染(吴丽圆, 2004; 胡凤荣等, 2011)。简易CTAB法、CTAB-高盐法提取的DNA在检查时，OD₂₆₀/OD₂₈₀均在2.0左右，纯度较高，SDS-CTAB法提取的DNA纯度较低，有一定RNA、蛋白质或是其它有机物质污染。当OD₂₆₀/OD₂₃₀的数值处于2.0左右时，表明小分子、盐离子和色素等杂质含量较少(桂腾琴等, 2008; 张惠云等, 2009; 胡凤荣等, 2011)，由表1可知，简易CTAB法杂质较少，纯度最高，CTAB-高盐法纯度最低，有严重的盐离子等杂质的混入。

表1 4 种方法提取百合的DNA 纯度, 得率, 浓度及耗时 Tabla 1 Purity, yield, concentration, and time consuming for the lily DNA extraction by four methods

4种提取方法中，简易CTAB法提取的DNA产量最多，其浓度为190.04 ng/μL，得率为57.01 μg/g；SDS-CTAB法提取DNA的量最少，其浓度为76.7 ng/μL，得率为23.02 μg/g。

1.2 DNA质量的凝胶电泳检测
用CTAB-高盐法、简易CTAB法、SDS-CTAB法及CTAB-硅珠法等4种方法提取杂种后代试管苗叶片DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测(图1)。结果显示，没有检测到DNA条带的只有CTAB-硅珠法，其余3种方法获得的DNA条带均无明显的拖尾现象，完整性好。4种方法在去除蛋白质、多糖、酚类化合物等次生代谢物的效果上存在差异。A1、A3的点样孔存在不同程度的光亮，表明SDS-CTAB法所提取总DNA样品中含有多糖、蛋白质等次生代谢物，这些次生代谢物质会与DNA形成复合物，使部分DNA电泳速度减慢或无法离开点样孔(詹亚光和曾凡锁, 2005)。从电泳结果观察DNA纯度，简易CTAB法和CTAB-高盐法对于去除蛋白质、多糖、酚类化合物等次生代谢物效果较好。综合比较，简易CTAB法要比CTAB-高盐法步骤简单、节省时间，因此效果更佳。

图1 ４种方法提取DNA电泳结果 Figure 1 Electrophoresis result of the extracted DNAs by four methods

为检验简易CTAB法的优越性，提取16个杂种后代试管苗叶片的DNA进行琼脂糖凝胶电泳(图2)。结果显示，16个样品DNA均条带清晰，点样孔干净，且无拖尾现象，说明DNA完整性好、质量高，可用于进一步研究。

图2 简易CTAB法提取部分样品DNA电泳图 Figure 2 Electrophoresis of parts of DNA samples extracted by simple and ease CTAB method

2讨论
由于植物组织中许多次生代谢物质，如多糖、脂类、酚类物质随个体的生长发育而不断成熟并增多，选择幼嫩叶片可以减少色素、酚类等物质，从而提高DNA的纯度，并且嫩叶也易于研磨，避免褐变。选取东方百合杂种试管苗叶片作为提取材料，能够获得高质量的基因组DNA。而高效、高纯度的DNA分离方法是扩增检测成功的关键(邓明文, 2008; Gluiiano et al., 2002; 胡建平和吴琦, 2008)，且提取过程中蛋白质、盐离子及酚类等物质会影响多种酶的活性，对后续操作会造成较为严重的不利影响，因此需要对DNA进行分离、纯化。采用SDS-CTAB法提取东方百合杂种试管苗叶片DNA的操作步骤繁琐，由于氯仿：异戊醇(24:1)抽提次数少，提取的DNA存在较多蛋白质、RNA及其它有机物质的污染；若用此法提取DNA，在纯化时则需要增加氯仿：异戊醇(24:1)抽提的次数，以去除蛋白质、RNA及其它有机物质的污染，提高DNA质量。CTAB-高盐法提取的DNA检测出严重的盐离子等杂质污染，可能是由于NaCl浓度过大或-20℃沉淀时间过长，导致盐离子等杂质难以去除，因此为提高此法所提取DNA的质量，应缩短低温沉淀时间或增加DNA的洗涤次数，消除盐离子等杂质污染。简易CTAB法提取的DNA不存在蛋白质、盐离子及酚类等物质的污染，但是存在很少量RNA污染，为获得高效、高纯度的DNA，需对提取产物采用RNA酶进行消化，以解除RNA的干扰。此法纯化所需时间最少，适于大量样品的DNA提取。DNA纯度、得率及耗时是衡量DNA提取优劣的重要标志。本研究利用4种方法提取杂种试管苗叶片DNA时，CTAB-硅珠法未获得DNA，可能是低温状态下硅珠漂洗液处于过饱和状态，使提取难度增大，同时与材料本身DNA含量低且步骤较多、损耗严重有关(胡凤荣等, 2011)。简易CTAB法提取的DNA纯度较高，OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.98，OD₂₆₀/OD₂₃₀为2.01，浓度为190.01 ng/μL，得率为57.01 μg/g，耗时3 h左右，介于CTAB-硅珠法和SDS-CTAB法之间。由于简易CTAB法提取的基因组DNA杂质含量少、纯度较高，且操作简单、方便，耗时较少，可作为东方百合杂种群体大量杂种后代试管苗叶片总DNA提取的首选方法，为进一步开展百合的分子生物学研究奠定物质基础。采用简易CTAB法提取了‘Sorbonne’בFrancia’杂种群体中273个杂种后代试管苗叶片的基因组DNA，利用ISSR分子标记方法进行了杂种真实性鉴定，获得了251个真实杂种，真实杂种率为91.94%。选取部分真实杂种叶片离体接种百合灰霉菌，进行灰霉病抗性检测，获得了良好的检测结果。

3材料与方法
3.1材料与试剂
以东方百合‘Sorbonne’בFrancia’的杂种后代试管苗叶片为材料，用70%酒精对叶片表面消毒，于4月14日采集分装于自封袋，液氮速冻后，存放于-70℃冰箱备用。

试验所用试剂及药品有CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)、EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠)、GusCN (硫氰酸胍)、PVP (聚乙烯吡咯烷酮)、SDS (十二烷基磺酸钠)、Tris (三羟基氨基甲烷)、Tris平衡酚、β-巯基乙醇、琼脂糖、盐酸、乙酸钾、乙酸钠、冰乙酸、氯化钠、氢氧化钠、异丙醇、异戊醇、无水乙醇、三氯甲烷、硅珠粉、goldview、DNA Ladder、液氮等。试剂参照邓明文(2008)的方法进行配制。

3.2总DNA提取
总DNA提取方法参考邓明文(2008)提取岷江百合总DNA的方法，并根据本研究的实际情况略有改进。

3.3总DNA质量与纯度检测
移液枪抽取1 μL DNA样品，以TE为空白液调零，取1 μL DNA样品用Thermo公司生产的紫外分光光度计检验，计算OD₂₆₀/OD₂₈₀比值、OD₂₆₀/OD₂₃₀比值、DNA得率，DNA得率=DNA浓度×总样品体积/样品鲜重。

取5 μL总DNA溶液在0.8%琼脂糖凝胶上电泳后，Gold view染色，用BioRad凝胶成像系统拍照，检测提取的DNA质量。

作者贡献
国荣荣是本实验研究的主要完成人；王斐和王江勇完成数据分析；国荣荣和王斐完成论文初稿的写作；第一作者兼通讯作者胡凤荣是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作，确定修改及定稿。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由江苏省高校优势学科建设工程项目资助。

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