结球甘蓝(Brassica olereaca L. var capitata L.)霜霉病是由活专性体寄生菌Hyaloperonospora parasitica (formerly Peronospora parasitica (Pers. ex Fr.) Fr.)引起的世界性叶片真菌性病害，苗期引起苗床损失，成株期引发叶片掉落或叶片提早衰老而影响产量和质量，尤其在春秋季节或温室温湿的气候条件下经常发生(Kucharek, 1985; Jensen et al., 1999)。中国结球甘蓝霜霉病主要在气候潮湿冷凉的沿江、沿海地区及高山反季节蔬菜生产区易流行，长江中下游地区，以秋播结球甘蓝受害较为严重，高山区从3月早春苗床开始至10月高山菜结束均可发生，尤以4~7月发生较重(李德友等, 2007; 王连荣, 中国农业出版社, pp.188-191; 赵毓潮等, 2006, 湖北植保, (1): 11, 18)。为防治病害，频繁使用农药，破坏生态平衡，也威胁到人们的健康，因此，发掘、利用抗病资源，培育抗病品种是最有效、最环保的途径。随着分子标记技术日趋成熟，其标记建立在DNA基础上，不受环境影响而进行准确高效的选择，也能加速新品种选育进程(王晓武和方智远, 2001)。

自Agnola等(2000)和Farinhó等(2000)利用BSA法，结合RAPD和AFLP标记进行筛选与抗性位点连锁的分子标记研究以来，甘蓝类蔬菜霜霉病抗性连锁的分子标记有了长足的发展。

Giovannelli等(2002)利用BSA法在青花菜子叶期对F₂群体的100个单株进行RAPD筛选，发表了第1张与抗霜霉病基因连锁的连锁图谱，获得了8个与显性抗性位点连锁的RAPD标记，并将其中2个标记转化为SCAR标记；Farinhó等(2004)通过AFLP、RAPD及ISSR等技术，寻找到青花菜成株期与抗霜霉病基因紧密连锁的两个分子标记OPK172980和AT1CTA2133/134，遗传距离分别为3.1 cM和3.6 cM。Farinhó等(2007)还在青花菜成株期，通过构建F₂群体遗传图谱获得8.5 cM内与单显性Pp532抗性位点连锁的3个SCARs和2个CAPS标记，其中一个SCAR标记由遗传距离为2.8 cM AFLP标记转化得到。

甘蓝类蔬菜抗霜霉病分子标记研究相对成熟，但结球甘蓝抗霜霉病分子标记研究相对匮乏，本研究利用抗病和感病高代自交系构建F2群体，运用Michelmore等(1991)提出的BSA法与AFLP标记相结合，筛选与结球甘蓝苗期抗霜霉病紧密连锁的候选分子标记，继续进行抗、感池和单株验证，转化为SCAR标记，并将该标记在部分结球甘蓝种质中进行了验证，为分子标记辅助选择提供理论基础，加速结球甘蓝抗霜霉病育种进程。

1结果与分析
1.1霜霉病抗性遗传分析
对抗病亲本‘R103’和感病亲本‘S101’及其构建的F₂群体、RBC1和SBC1群体株进行Hyaloperonospora parasitica田间自然抗性鉴定。在2010年10月25日左右，病害高发期进行三次病害调查，第一次病害调查结果稍轻，后两次病害情况趋于稳定，因田间种植密度和自然温湿度，最后一次病害调查结果，发病率小幅提高，所以对第二次病害调查结果进行分析。经统计，在F₂群体抗感比为2.93:1 (抗病单株208株:感病单株71株)，经卡平方χ²适合性测验，χ_c²=0.010 8 (<3.84 (χ_{0.05, 1}))，以感病亲本为回交亲本的BC1群体抗感比为0.91:1 (抗病单株132株:感病单株145株)，经卡平方χ²适合性检测，X_c²=0.519 9 (<3.84 (χ_{0.05, 1}))，根据上述F₂群体和SBC₁群体抗性分离比例符合3:1和1:1，表明各个群体抗性符合孟德尔遗传规律，结球甘蓝霜霉病抗性单基因显性控制。

1.2抗性相关AFLP标记分析
1.2.1预扩增产物的检测
两对抗、感池和两亲本DNA进行酶切连接后，利用EcoRⅠ和MseⅠ预扩增引物进行预扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测16个循环的PCR预扩增结果，从图1看出清晰、均匀、稳定的条带主要分布在100~500 bp左右，表明基因组DNA酶切彻底，接头连接效果较好，可继续进行AFLP分析。

图1 2对抗感池及亲本预扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳 Figure 1 Pre-amplified products of two pairs of resistant and susceptive pools and their parents by electrophoresis with 1% agarose gel

1.2.2 AFLP差异带筛选及特异带验证
采用了64组引物组合对首先1对抗、感池进行了筛选，结果所有的引物均能扩增出稳定、清晰的带纹，分子量一般在100~500 bp之间，平均每对引物组合可扩出45条带左右。多数引物在基因池间不存在多态性差异，而少数分引物组合存在差异带，主要是在抗病池中存在而感病池中没有，只有引物组合E-AGG/M-CAC在感病池中扩增出差异带。通过对扩增出差异条带的引物组合E-AAC/M-CAC、E-AAG/M-CTC、E-ACA/M-CAG、E-ACA/M-CTC、E-AGC/M-CAT、E-AGG/M-CAC和E-ACG/M-CTC进行亲本验证表明，得到的7对引物组合中，5对在亲本中均未扩增出相应的差异条带(图2A)，说明在基因池扩增出的差异带可能为假阳性条带，继续经另1对抗、感池验证后，只有引物组合E-AAG/M-CTC和E-AAC/M-CAC在两对抗病基因池和抗病亲本中扩增出两条特异带(图2B; 图2C)，初步推测可能与抗病性相关，分别将其命名为BoRAAG/CTC和BoRAAC/CAC。

图2 AFLP差异带筛选及验证 Figure 2 Validation and screen of the differential fragments generated with AFLP markers

1.2.3特异带序列分析
BoR_AAG/CTC和BoR_AAC/CAC特异带回收克隆，测序后，获得191 bp和204 bp大小的两个片段(图3)。将片段序列在NCBI网站BLAST分析后，BoR_AAG/CTC片段没有相应的同源序列，并进行登录，登录号为EU635443.1；BoR_AAC/CAC片段与结球甘蓝编码S-位点受体激酶的S-12 SRK基因(AB180901.1)cDNA部分序列同源性为90%，无其它匹配信息。

图3 BoRAAG/CTC和BoRAAC/CAC目的片段序列 Figure 3 The sequences of target fragments generated with BoRAAG/CTC and BoRAAC/CAC

1.3 SCAR标记转化
1.3.1 SCAR标记引物设计
根据BoR_AAG/CTC和BoR_AAC/CAC特异片段序列设计引物，首先两组引物组合不含有EcoRⅠ和MseⅠ酶切位点和选择性碱基的引物序列，其次考虑所设计的引物中GC碱基含量和退火温度，引物的位置最好不要从两个末端开始，稍微向片段中间靠拢。AFLP目的片段BoR_AAG/CTC得到1对正、反向各21 bp的引物组合，目的片段BoR_AAC/CAC，根据序列获得1个22 bp的正向引物和21 bp的反向引物(表1)，两组引物组合预备扩增的目的片段都大于100 bp。

表1 BoRAAG/CTC和BoRAAC/CAC片段的SCAR引物 Table 1 SCAR primers derived from the fragments generated with BoRAAG/CTC and BoRAAC/CAC

1.3.2 SCAR标记亲本和抗感池验证
用2对抗、感池和双亲及相应的质粒对SCAR标记进行验证，BoR_AAC/CAC片段在2个抗病池、抗病亲本和相应质粒中都可扩增出比较亮的100 bp左右的目的条带，而2个感病池和水中均扩出大小一致的较弱的目的条带(图4A)，表明该片段主要是在量上的区别不是质上的区别，不是理想的分子标记，与AFLP分析结果不同，可能是AFLP操作步骤较多，造成假阳性。从图4B中看出BoR_AAG/CTC标记在2个抗病池、抗病亲本和相应质粒中都可扩增出100 bp左右的目的条带，而2个感病池和水中均没有目的条带，扩增结果与AFLP分析一致，可能是一个比较理想的SCAR标记，命名为BOR_AAC/CAC113。

图4 BoRAAC/CAC片段SCAR特异引物在抗, 感亲本, 基因池, 质粒和空白对照(水)的验证 Figure 4 Identification of the two designed SCAR primers in the resistant and susceptive parents, two pair gene pools, plasmid and blank control (water)

1.3.3 BOR_AAC/CAC113 SCAR标记的单株检测
为了进一步确认BOR_AAC/CAC113标记与结球甘蓝霜霉病抗性位点的连锁遗传距离，以田间自然鉴定的苗期131个抗、感单株的F₂群体进行单株检测，从图5中看出，构建抗病和感病基因池的40个单株，20个抗病单株(R5, R7, R13, R21, R26, R33, R34, R45, R59, R66和R71-80)都扩增出了113 bp的母的条带，20个感病单株(S11, S12, S25, S1-6, S15-20和S31-35)均没有特异条带出现。在96个抗病株中，大部分单株仅扩出一条特异条带，只有R57和R60 2个单株没有得到和抗病亲本相同的特异条带，35个感病株中，S9、S13、S22、S23和S30 5个单株扩出特异条带，表明131株中7株进行了交换，交换率为5.3%，经软件统计分析，BOR_AAC/CAC113标记与抗性位点的遗传距离为5.7 cM，是一个简单可靠，可用于辅助选择的SCAR标记。

图5 BoRAAG/CTC SCAR标记F2单株1.5%琼脂糖电泳检测 Figure 5 Detecting results of F2 individuals with BoRAAG/CTC SCAR marker by electrophoresis with 1.5% agarose gel

1.3.4 BOR_AAC/CAC113 SCAR标记的验证
1.3.4.1 F₁和BC₁群体验证
SCAR标记BOR_AAC/CAC113在抗病亲本和感病亲本构建的F₁和BC₁群体(10个单株混合)中进行验证(图6)，在抗病亲本、2对抗病池、以及以抗病亲本为回交亲本的BC₁群体和以感病亲本为回交亲本的抗病群体中，扩增出相同的100 bp以上的一条特异带。而在感病亲本、2个感病池和以感病亲本为回交亲本的BC₁感病群体中，没有扩增到任何特异带，表明此标记确实与抗霜霉病基因紧密连锁，可用于结球甘蓝材料或品种抗性鉴定。

图6 BoRAAG/CTC SCAR标记F1和BC1群体验证1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 Figure 6 Detecting results of F1 and BC1 validated with BoRAAG/CTC SCAR Marker by electrophoresis with 1.5% agarose gel

1.3.4.2结球甘蓝种质抗性鉴定
为了进一步检测和应用SCAR标记BOR_AAG/CTC113 ，我们对本研究所的20份多代自交材料(经多年苗期霜霉病抗性鉴定)进行抗性鉴定，在10份抗病材料中都得到该特异标记，而10份感病材料中，只有1份材料扩增出100 bp左右的特异条带(图7)，BoR_AAG/CTC113标记与这20份种质的霜霉病抗性吻合率达95%，表明该SCAR标记可以可靠的用于结球甘蓝霜霉病抗病性鉴定、辅助选择等。

图7 BoRAAG/CTC SCAR标记不同试材验证1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 Figure 7 Detecting results of different experimental materials validated with BoRAAG/CTC SCAR Marker by electrophoresis with 1.5% agarose gel

2讨论
霜霉病是十字花科蔬菜世界性的三大病害之一，对甘蓝及其他相关种类的蔬菜具有毁灭性的危害。栽培抗病品种是最佳的控制方法，因为这为限制该病的发生提供了一项长期的、实用的和环境友好的措施。

研究表明，甘蓝类蔬菜霜霉病的抗性鉴定相当复杂，同时也是开展霜霉病研究的一个关键环节。采用子叶、幼苗和成株等不同材料对不同生理小种的抗感性反应均有所不同，更为有趣的是，其抗性的遗传规律也表现出较大的差异。Coelho和Monteiro (2003)的研究结果显示，甘蓝类蔬菜的子叶和成株两个发育阶段对霜霉病的抗感性反应几乎不存在着相关性，并显示出明显的种类特异性。与大多数以成株为材料的鉴定结果一样，本研究中高代自交系‘R103’抗病亲本的霜霉病抗性是由一对显性基因控制(Farnham et al., 2002; Monteiro et al., 2005; Vicente et al., 2012)。然而，Wang等(2001)在3~4片真叶期评估了F₂和BC₁F₁群体进行人工接种病霉病菌(H. parasitica)的反应，结果显示，青花菜品种Everest的霜霉病抗性由两个互补的显性基因控制。Hoser-Krauze等(1995)在子叶至4~5叶期对来自波兰的白花菜和青花菜霜霉病的抗性筛选结果发现，其抗性由三个或四个互补的显性基因控制。由此推测，甘蓝类蔬菜霜霉病的抗性比原来想象的要更加复杂和多样，很有可能是由多个主效基因控制的；同时，霜霉病的抗性鉴定不要以子叶和幼苗为材料，以成株为宜。在同为芸薹属的白菜类蔬菜中获得了相似的结果(程永安和柯桂兰, 1995; 王洪久, 1994)。Yu等(2009)通过对100个DH群体的单株进行SSR筛选，整合已获得的STS、SRAP、SCAR和同工酶等分子标记，获得了总长为1 070.5 cM，平均距离为2.06 cM的大白菜遗传图谱，分析结果显示，AA基因组中霜霉病的抗性位点被定位在第8连锁群中K14-1130和PGM两个分子标记之间，该位点能解释68.6%的表型变异。最近，Yu等(2011)将白菜抗霜霉病RAPD标记K14-1030转化为简单易行的SCAR标记。

迄今为止，国内外研究者利用BSA法，结合RAPD、AFLP、CAPS和ISSR等分子标记技术，在甘蓝类蔬菜中筛选获得了多个与霜霉病抗性位点紧密连锁的分子标记OPK172980、AT1CTA2133/134、SCJ19、SCR15和SCAFB1 (Giovannelli et al., 2002; Farinhó et al., 2004; 2007)。随后，Carlier等(2011)利用作图法将单显性的Pp532位点定位在青花菜的第8染色体上，并将抗性基因缩小在3 000 bp的范围之内，为下一步的精细定位和定位克隆奠定了研究基础。遗憾的是，上述与霜霉病抗性位点紧密连锁的分子标记均来自青花菜，目前还未见有关结球甘蓝霜霉病抗性基因分子标记的研究报道。本文运用AFLP分子标记技术和BSA法，利用纯系抗病亲本‘R103’和感病亲本‘S101’构建F₂分离群体，采用成株田间自然诱发抗性鉴定，获得2个与结球甘蓝抗霜霉病基因相关的AFLP标记BoR_AAC/CAC和BoR_AAG/CTC113，并将上述两个分子标记转化为SCAR标记。单株验证结果显示，BoR_AAC/CAC在抗病亲本和抗病池中与感病亲本和感病池中条带仅存在量上的差异，这可能与抗感亲本中该位点的序列存在拷贝数的差异有关，但这一假设有待于今后进一步实验结果的证实。而本研究结果表明，另一个分子标记——BoR_AAG/CTC113与结球甘蓝霜霉病抗性基因的遗传距离为5.7 cM，连锁较为紧密。为了验证该分子标记的可靠性和准确性，我们利用BoR_AAG/CTC113SCAR标记对20份结球甘蓝种质资源进行验证试验，结果显示，该标记与品种(系)的霜霉病抗性吻合率达到95%，该结果表明，BoR_AAG/CTC113SCAR标记可以应用于结球甘蓝的早期抗霜霉病抗性基因的分子标记辅助育种选择。

目前，甘蓝基因组测序和组装工作已基本完成(王晓武, 2012, 私人通讯)，由于CC基因组中霜霉病的抗性较为复杂，待甘蓝基因组释放后，我们拟根据BoR_AAG/CTC113的分子信息，通过进一步的精细定位，最终分离获得结球甘蓝抗病亲本‘R103’中霜霉病的抗性基因，并通过基因插入突变和超量表达等方法，分析其可能的生物学功能，从而为甘蓝类蔬菜的抗霜霉病的遗传改良奠定研究基础。

3材料与方法
3.1实验材料
用于标记获得的抗霜霉病亲本：高代自交系R103；感霜霉病亲本：高代自交系S101，及两者构建的F₁、F₂ (131个单株)、BC₁群体和用于SCAR标记验证的10个抗病高代自交系和10个感病高代自交系材料，均由江苏省农业科学院蔬菜所提供。

本研究所用的AFLPTM分析系统I试剂盒购自GIBCOBRL公司，大肠杆菌DH5α、pUCm-T-Vector及其它的试剂均购自Promega、Sigma和上海生工。AFLP所用接头和引物(表2)由上海生工合成。

表2 AFLP分析所用的接头和引物 Table 2 Adapters and PCR primers used in AFLP analysis

3.2霜霉病抗性鉴定
通过病原菌显微镜检及病害症状鉴定病害，田间自然鉴定，种子在50℃温水冲洗10 min左右，在无菌基质中种植，密度100株/m²，自然环境下生长6片叶左右大小，在病害发生高峰期每5 d采用五点式进行3次病害发生调查，植株没有或者少于3个小的病斑(直径<0.4 mm)为抗病，有大于3个病斑或更大的病斑为感病。

3.3 AFLP分析
AFLP分析参照GIBCOBRL公司的AFLPTM试剂盒说明书进行，稍有改动。其中条带的显示采用银染法，部分步骤略有改动。

甘蓝基因组DNA提取与纯化采用CTAB法：提取F₂单株DNA，利用BSA法构建2对抗、感池(各取抗病和感病10个单株DNA等量混合)，用于AFLP引物的多态性筛选和分析。

抗、感基因池构建：用集团分离分析法(BSA法)构建基因池，分别取F₂群体中抗病植株和感病植株DNA各10株等量混合，构成1对抗、感池，然后用同样的方法构成第2对抗、感池。

基因组DNA酶切连接：取150 ng基因组DNA，采用EcoRⅠ和MseⅠ进行双酶切。37℃酶切6 h，酶切后于70℃水浴处理15 min灭活酶；在酶切产物中加EcoRⅠ接头和MseⅠ接头及T4 DNA连接酶，20℃或室温连接过夜。

酶切连接产物的扩增：取2.5 μL酶切连接产物为模板进行预扩增。预扩增PCR反应程序：94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，16个循环。预扩增产物1:50稀释，作为选择性扩增的模板。选择性扩增引物组合由8个带3个选择性碱基的EcoRⅠ-NNN引物和8个带3个选择性碱基的MseⅠ-NNN引物组成64对。选择性扩增程序为：94℃预变性120 s，94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸60 s，经13个循环(每个循环退火温度降低0.7℃)，继续进行28个循环的扩增：94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s后72℃延伸420 s。

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及显影：将选择性扩增样品加入等体积的甲酰胺上样缓冲液(10 mmol/L EDTA, 98%甲酰胺, 0.25%溴酚蓝和0.25%二甲苯青)，95℃变性5 min，置于冰上冷却。取5 µL上样，60 W恒功率，6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳2~3 h (约胶底约10 cm处)，结束电泳后进行银染显色。

3.4 AFLP特异片段的回收、克隆和测序
用灭菌针尖挑起差异带，放入加了50 µL ddH₂O PCR管中，37℃温浴1 h，作为反应模板，再次以相应的引物组合，相同的选择性条件进行扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证片段大小后，连接于pEASY-T1载体上，单菌落质粒提取后，经酶切鉴定，送至上海生工进行测序。将测序得到的核甘酸序列在NCBI上应用BLAST程序进行同源性检索。

3.5 SCAR标记转化验证
测序后，去除接头序列，根据剩余的序列，利用Primer5.0软件设计SCAR引物，由上海生工合成。以F₂代单株的基因组DNA验证引物的特异性，并用MAPMAKER/EXP3.0 (Kosambi)软件计算遗传距离和重组率；继续以F₁、BC₁群体、抗病t感病材料各10个进行SCAR标记验证。扩增程序为：94℃预变性180 s，然后94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s；35个循环，72℃继续延伸420 s。扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳检测。

作者贡献
王神云、李建斌是本研究的实验设计和实验研究的执行人；王神云和余小林完成数据分析，论文初稿的写作；黄建新参与实验设计，试验结果分析；曹家树和李建斌是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由江苏省科技支撑计划项目资助(BE2008378)、国家科技支撑计划项目(2008BADB1B02)和浙江省农业科技专项(2012C12903-6-1)共同资助。

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