水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的三大粮食作物之一，全世界二分之一以上的人口以水稻为主食。近年来，环境污染加剧、耕地面积减少等因素使得全球粮食安全问题越来越严峻，因此，不断提高水稻的产量越发显得重要。叶片是植物光合作用的主要器官，水稻产量的95%来自叶片叶绿体的光合作用(Leister, 2003)。由此可见，提高水稻产量的一个重要途径就是提高叶片的光合作用效率。

叶绿体的正常发育需要叶绿体基因及其相关核基因相互协调作用，这些基因发生突变往往会影响叶绿体发育，并有可能使得叶片中的色素含量发生变化。叶色突变通常是由于叶绿素的合成及降解途径受阻所致，所以叶色突变体往往又被称之为叶绿素缺失突变体(刘朝辉等, 2012)。综上所述，叶色突变体在植物光合作用、叶绿素合成、叶绿体遗传及发育等研究中具有重要的研究价值。

水稻全基因组测序工作顺利完成更进一步便于水稻基因克隆与功能的研究(Yu et al., 2002; Goff et al., 2002)。因此，可以通过对水稻叶绿素缺失突变体进行基因克隆及功能分析，来阐明叶绿素合成的生物机制。本研究通过⁶⁰Co γ射线辐射诱变粳稻嘉花1号种子，从诱变后代中筛选出一个黄叶突变体，在对该突变体表型及生理特征的长期观察的基础上对该突变体进行了遗传分析及基因定位方面的研究，表明该突变体是一个新的叶绿素缺失突变体。本研究为该基因的克隆及功能分析等方面的进一步研究奠定了基础。

1结果与分析
1.1突变体yl6的表型性状分析
比较苗期野生型嘉花1号与变体突yl6的叶色表型，发现：与野生型嘉花植株相比，突变体yl6苗期叶色不论在低温(20℃; 图1A; 图1C)还是在高温(32℃; 图1B; 图1D)条件下均呈现出淡黄色，推测该突变体是一温度不敏感的黄叶突变体。

图1 不同温度下嘉花1号与突变体yl6幼苗叶色表型 Figure 1 Leaf-color phenotypes of wild-type “Jiahua 1” and rice mutant yl6 under different temperatures during the seedling stage

1.2突变体yl6叶片中光合色素含量分析
测定32℃培养条件下生长的野生型与突变体的光合色素含量，结果表明，突变体yl6叶片中所含的叶绿素和类胡萝卜素的含量均远低于野生型嘉花1号(表1)。与野生型嘉花1号相比，突变体叶片中所含总叶绿素、叶绿素a及叶绿素b的含量分别下降了23.72%、23.61%和24.16%，而叶绿素a/b的值无明显变化，说明yl6突变体的黄叶突变性状主要是由叶绿素a、b含量的大幅下降所导致的，是一个叶绿素缺失黄叶突变体。此外，20℃条件下生长的突变体光合色素含量与32℃条件下生长的突变体光合色素含量相差不大，且相对于野生型也有明显的下降(表2)，表明温度对该突变体光合色素的形成无明显的影响。

表1 32℃下嘉花1号和突变体yl6苗期幼叶中光合色素的含量(平均值±标准误差) Table 1 Photosynthetic pigment contents in wild-type parent Jiahua No.1 and its mutant yl6 at 32℃ during the seedling stage (means±SE)

表2 20℃下嘉花1号和突变体yl6苗期幼叶中光合色素的含量(平均值±标准误差) Table 2 Photosynthetic pigment contents in wild-type “Jiahua 1” and its mutant yl6 at 20℃ during the seedling stage (means±SE)

1.3突变体yl6的叶绿体形态结构观察与分析
使用透射电镜对野生型嘉花1号和突变体yl6的叶片中叶绿体形态进行观察，以查明突变体叶片中叶绿体的发育是否受到了影响。电镜观察结果表明，野生型嘉花1号叶片中叶绿体内基粒正常，类囊体排列紧凑且垛叠整齐规则，此外基粒类囊体和基质类囊体间的连续性较好(图2A; 图2B)，叶绿体发育正常。与之相反，在突变体yl6叶片呈淡黄色部位中的类囊体排列疏松且不规则，且基粒类囊体和基质类囊体间的连续性较差(图2C; 图2D)。由此推测yl6突变体叶片内不但叶绿素的合成受阻，而且叶绿体的正常发育也受到了影响。

图2 野生型嘉花1号(A, B)和突变体(C, D)叶绿体超微结构 Figure 2 Transmission electron microscopy pictures of chloroplasts of wild-type “Jiahua 1”(A, B) and its mutant yl6 (C, D)

1.4突变体yl6遗传分析
将突变体yl6与籼稻品种培矮64S进行杂交，所得到的F₁群体在幼苗期均表现正常的绿叶表型，而F₁繁殖得到的F₂群体叶色在幼苗期出现了野生型绿叶表型和突变体黄叶表型的分离。对随机抽取的456株F₂植株进行黄绿苗分离情况统计，其中具有正常绿叶表型的植株为347株，具有黄叶表型的植株为109株。经χ²测验，植株的分离比例符合3:1 (χ²=0.87<χ²0.05=3.84)，这表明突变体yl6的黄叶性状是受到1对隐性核基因调控的。

1.5叶绿素缺失黄叶突变体基因yl6的定位
通过417对SSR分子标记对培矮64S和突变体yl6进行多态性筛选，选择均匀分布于水稻12条染色体上的具有多态性的64对分子标记对F₂代的纯合隐性单株DNA池(22株)进行连锁分析，发现该突变性状与SSR分子标记RM19324和RM19295有连锁关系，由此将该突变基因yl6定位于水稻第6号染色体分子标记RM19324和RM19295附近，进一步扩大群体获得608株具有突变黄叶表型的F₂、F₃植株，利用新设计的CAPS分子标记(表3)以及新合成的SSR标记，最终将突变基因yl6定位于RM2353与CAPS1之间约271 kb的范围内(图3)，该区域跨越AP001389、AP002837和AP003564三个 BAC克隆群。

图3 叶绿素缺失突变黄叶基因yl6在水稻第6染色体上的位置 Figure 3 Location of yl6 gene on rice chromosome 6

表3 新设计的分子标记引物 Table 3 Sequence of new designed molecular markers in this study

2讨论
植物的叶色突变是一种非常明显的性状，其主要特点是叶色表型发生了变异，表现出不正常的黄化、白化、绿白和条纹等。叶色突变基因可直接或者间接影响植物叶绿素的合成和降解，导致光合效率下降、从而造成农作物减产，严重时甚至导致植株的死亡(Jung et al., 2003; Sugimoto et al., 2004; Ihnatowicz et al., 2004; Nagata et al., 2005; Chen et al., 2005)。所以，植物叶色突变体在植物光合作用、叶绿素合成与代谢等方面具有重要的研究价值。此外，在遗传育种中，叶色变异作为标记性状,简化了杂交种的生产过程(田明爽等, 2011)。

在高等植物中，已对许多叶色突变体进行了研究，例如拟南芥(Noutoshi et al., 2005)、番茄(Isaacson et al., 2002)、水稻(Carol et al., 1999)、玉米(Lonosky et al., 2004)、大麦(Rzeznicka et al., 2005)等。随着生物化学与分子生物学的快速发展，水稻叶色突变相关基因的研究成为国内外研究的热点。据不完全统计，目前已报道的水稻叶色突变相关的基因有80多个，其中已进行较详细分子定位的基因有10多个，其中6个基因已被克隆，如v1 (Kusumi et a1., 1997)、v2 (Sugimoto et a1., 2004; 2007)等，但是这些突变体的发现仍未彻底揭示叶绿体发育的复杂过程，因此需要通过对更多的叶色突变体进行研究来揭示叶绿体发育(合成)的全过程。目前水稻中有相关报道的叶色突变体主要是一些温敏感叶色(叶绿素缺失)突变体，如w4、w11、w17、w25 (舒庆尧等, 1996; 刘贵富等, 1996)、v1(Kusumi et a1., 1997)和v2(Sugimoto et a1., 2004; 2007)。其中，研究的比较详细的有低温黄化型水稻突变基因v1和低温白化型水稻突变基因v2。v1通过调控质体基因的表达来抑制叶绿体的分化(Kusumi et a1., 1997)；v2编码一个鸟苷酸激酶，它通过对细胞器中鸟苷酸的合成产生影响，从而抑制叶绿体的分化(Sugimoto et a1., 2007)。此外，温度不敏感叶色突变体也逐渐被发现，如yl11 (刘朝辉等, 2012)和ygl1 (Wu et al., 2007)。yl11是一种全生育期叶色黄化突变体，叶色在幼苗期和成熟期均变现出黄化表型。而ygl1是一种仅在幼苗期表现出叶色黄化的叶绿素缺失突变体，其在成熟期叶色与野生型相比无明显差别。本研究中的突变体yl6与ygl1相似，是一种仅在幼苗期表现出叶色黄化的叶色突变体，且这种叶色的变化并不随着温度的改变而改变，但是与ygl1不同的是，yl6相对于野生型并没有表现出明显的矮化，故推测本研究筛选出的黄叶突变体yl6是一个不同于以往所发现的叶绿体缺失突变体的新的叶色突变体。

本研究对叶色突变基因yl6进行了精细定位，最终将其定位于水稻第6号染色体短臂上的RM2353与CAPS1之间约271 kb范围内(图3)，跨越3个BAC (http://ricegaas.dna.affrc.go.jp, AP001389, AP002837, AP003564)克隆群，包含了53个ORF，至今在该区域尚发现其它的与叶绿体发育(或合成)相关的基因，由此推测YL6是一个新的与叶绿体发育(或合成)相关基因。今后的工作一方面是在此基础上在目标基因区域内发展更多新的分子标记，将该突变基因限定在更小的范围内，以便为该基因的克隆及功能研究提供理论基础。另一方面，在克隆该基因的基础上，进行互补实验，并对该基因进行功能研究。

3材料和方法
3.1水稻材料
经⁶⁰Co γ射线辐射诱变处理后的粳稻嘉花1号(Oryza sativa L. spp. Japonica cv. Jiahua No.1)种子为M1，M1代种子成熟后收获得到M2代种子。将M2代种子种植于田间，并对其不同发育阶段的表型性状进行观察，我们从中发现了一个新的叶绿素缺失黄叶突变体，对该突变体进行多次自交繁殖和筛选，最终其叶绿素缺失黄叶性状及各种农艺性状都达到稳定，暂命该突变体为yl6 (yellow leaf mutant 6)。

3.2突变体表型观察
野生型对照(嘉花1号)与突变体yl6在25℃条件下浸种催芽，待其发芽后(约4 d)，将其点播于水稻土中，然后放置在人工气候箱中培养(设置20.0℃和32.0℃两个温度, 每天12 h光照，光照强度均为180 pmol/m2•s)，观察幼苗的叶色变化情况。

3.3叶绿素和类胡萝素含量的测定
分别以一直在20℃和32℃条件下生长的三叶期苗野生型嘉花1号以及突变体yl6的第三片叶为材料，参照沈伟其的方法(沈伟其, 1998)提取叶绿素和类胡萝卜素。采用BECKMANCOULTER-DU720分光光度计分别测定提取液在663 nm、646 nm和470 nm三个波长下的吸光光度值(三次重复)，然后根据测定得到的数值计算出总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量以及叶绿素a/b的值。计算公式如下：
叶绿素a的含量(Ca)=12.71×A663-2.59×A645
叶绿素b的含量(Cb)=22.88×A645-4.68×A663
总叶绿素含量(C)=Ca+Cb
类胡萝卜素含量=(1000×A470-3.27×Ca-104*Cb)/229

3.4野生型嘉花与突变体yl6的叶片电镜切片观察
取32.0℃条件下生长至三叶期的野生型及突变体第3片叶相同部位的新鲜叶片，置于滴有固定液的载玻片上，用刀片快速切成约1 mm3的组织片段，用2%~4%戊二醛(0.1 mol, pH 6.8~ pH 7.4的磷酸缓冲液配制)在4℃条件下固定2 h，0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗后(4~5次, 30 min/次)，再用2% OSO4 (0.1 mol/L, pH 6.8~pH 7.4的磷酸缓冲液配制) 4℃固定2 h，再冲洗1~2次后，接着进行梯度脱水：70%丙酮15 min，80%丙酮15 min，90%丙酮15 min，100%丙酮10 min (两次)，然后使用环氧化树脂(SPURR)包埋、聚合，再在超薄切片机将其切成约1 cm厚的薄片，最后用柠檬酸铅染色液染色后，在Hitachi765型透射电镜下进行观察并拍照保存。

3.5遗传分析和定位群体的构建
2009年9月，于上海师范大学徐汇校区的水稻试验田，以突变体yl6为母本，籼稻品种培矮64S为父本进行杂交，杂交得到的F1种子于同年冬在浙江水稻所南繁基地(海南省陵水县)进行加代种植。2010年11月于上海师范大学遗传研究所奉贤水稻试验田，分单株收获得到F₃代种子(收获于用初定位区间内零分离标记检测为杂合型的F₂单株)。同年，将烘干的F₂和F₃代种子浸在水中并放置在25℃条件下催芽4 d后，将吐芽的种子点播在装有水稻土的盆里，放于32℃人工气候箱培养箱(光照强度设置为180 pmol/m2•s, 每天12 h光照)继续培养。约2周后，观察水稻幼苗叶色变化，并统计叶色分离情况。然后将从中筛选出的具有突变体叶色表型的幼苗移至培养箱中继续培养到3~4叶期，温度设为28℃ (晚上, 12 h)、32℃ (白天, 12 h)，光照强度设置为180 pmol/m2•s，然后分单株取叶片，提取基因组DNA。

3.6水稻基因组DNA的提取
亲本培矮64S、突变体yl6及筛选得到的F₂、F₃遗传群体的基因组DNA提取采用本实验室的TPS法(100 mmol/L Tris-HCl, 1 mol KCl, pH 8.0的10 mmol/L EDTA)。

3.7叶绿素缺失黄叶突变体(yl6)基因的定位
首先，选用417对gramene网站(http://www.gramene. org/)公布的SSR标记检测两亲本(培矮 64S和yl6)之间的多态性，选取出具有多态性的且在12条染色体上均匀分布的64对分子标记对22株具有突变表型的F₂代单株进行连锁分析，由此确定突变基因在染色体上的大致位置。为确定究竟是哪个基因发生突变，我们进行了精细定位，进一步扩大定位群体，并采用了目标区域内新开发的具有多态性的SSR分子标记，以及根据NCBI公布的“日本晴”和“9311”的全基因组序列之间的差异设计的CAPS标记。引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。10 μL的PCR反应体系包括：1.0 µL 10×PCR缓冲液、0.2 µL 2.5 mmol/L dNTPs、1.0 μL 10 µmol/L引物、1.0 µL模板DNA、0.1 µL 5 U/µL Taq DNA聚合酶以及6.4 µL ddH₂O。PCR反应在Eppendorf PCR仪上进行，反应体系条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，52℃~60℃复性30 s (复性温度随引物变化)，72℃延伸30 s，36个循环；72℃再延伸10 min。PCR产物经10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后快速银染并拍照观察。

3.8连锁分析
根据聚丙烯酰胺凝胶电泳得到的带型实验结果，采用MAPMAKER/EXP 3.0 (Lincoln et al., 1992)和MapPlotter (沈利爽等, 2000)软件构建目标区域的遗传图谱。

作者贡献
周华是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成实验设计和论文初稿的写作；潘佑找参与实验研究与数据分析；刘秀艳、马晓静、陈素丽、林冬枝和王俊敏参与实验设计，试验结果分析；董彦君和滕胜是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(31000094, 31200150, 30971552)资助。在项目实施过程中，得到了上海生命科学研究院植物生理生态研究所光合组李平博后和史晓亮博后的大力支持，对此表示衷心感谢。

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