植物品种权是植物育种者权益的法律保障。近年来，随着中国植物育种者品种权意识的不断增强，申请保护的植物新品种数量逐年增长。截止2012年6月，中国农业部累计收到国内植物品种权申请9 016件。根据中国植物新品种保护条例规定，植物新品种必需具备特异性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和稳定性(Stability) (简称DUS)，才能授予品种权。

特异性是指申请品种应当明显区别于申请日以前所有已知的同属或同种品种，是DUS测试中的关键环节(UPOV, 2002, http://www.upov.org/edocs/mdocs/upov/en/tc/38/tc_38_5.pdf)。而在特异性审查实践中，要将申请品种与所有已知品种进行比对往往是不可能的，也没有必要，通常的解决方法即测试机构从已知品种中筛选出近似品种，与申请品种田间相邻种植以进行判定。由此可见，近似品种的选择是DUS测试中的重要一环，直接关乎DUS测试的最终结果。

目前，在国际植物新品种保护联盟(UPOV)的一些重要成员国，如日本、法国和荷兰等，近似品种由DUS测试机构通过分组性状(用来排除特异性测试中不需要大量种植已知品种而采用的性状)来筛选。具体地说，测试机构首先建立已知品种的DUS测试性状数据库，利用分组性状逐个排除差异明显的品种，最后筛选出近似品种。该方法的缺点是，测试机构需要事先知道申请品种的DUS测试性状数据，这需要消耗大量的时间、劳力和财力。

SSR分子标记因其多态性丰富、不受环境影响、操作简单和快速等优点，广泛用于基因定位、分子指纹图谱的构建以及品种区分，是UPOV官方认可的构建DNA指纹库的标记(UPOV, 2010, http://www.upov.int/edocs/mdocs/upov/en/tc_edc/2006/bmt_guidelines_proj_4.pdf)。多数研究者认为，SSR分子标记可以用来区分大多数品种(陆光远等, 2008; Gunjaca et al., 2008; Ibáñez et al., 2009; 王凯华等, 2011)，最近，王立新等(2010)人研究表明，分子标记可以用来筛查小麦的相似品种，并应用于全国小麦区试中，以防止雷同品种进入审定程序。但是，迄今为止，还没有文献报道SSR标记在DUS测试中筛选近似品种的应用。

甘蓝型油菜是重要的油料经济作物，在中国公布的保护名录植物种类中，申请量位居第六。本研究通过对大量SSR标记的筛选，确定一套带型清晰、等位变异间易于区别、多态性丰富、重复性好的甘蓝型油菜SSR核心引物，并比较了品种基于SSR标记的聚类结果和系谱的一致性，旨在探讨采用SSR标记筛选甘蓝型油菜近似品种的可行性。

1结果与分析
1.1核心引物的筛选和评价
采用80份甘蓝型油菜品种对952对SSR引物进行筛选和评价，共筛选出49对核心引物(表1)。49对引物共检测到57个位点，分布于甘蓝型油菜的19个连锁群，平均每个连锁群3个位点，除CN48b位点尚未定位外，其余基本均匀分布在甘蓝型油菜19个连锁群上(图1)。大多数连锁群上检测到2~3个位点，因部分引物存在多个位点，少数连锁群上检测到的位点稍多，如N1、N3和N15连锁群上分别有4、5和5个(图1)。

表1 49对SSR引物的详细信息 Table 1 Comprehensive information of 49 pairs of SSR markers

图1 各连锁群上的位点数和等位变异数 Figure 1 The number of locus and allele on different linkage group

57个位点共检测到311个等位变异，平均每个位点5.5个，等位变异数最多的是位于第19连锁群的Na10E08位点(13个)；平均每个连锁群上16.4个等位变异，等位变异数最多的是第15连锁群(43个)，其余连锁群上被检测到的等位变异数差异不大(图1)。57个位点的PIC值变幅为0.04~0.88，平均为0.53。49对引物包括41对单位点引物和8对双位点引物。单位点引物的电泳图谱带型简单，各等位变异的带型容易区分(图2)。双位点引物的电泳图谱带型部分较复杂，但位点间容易区分，且带型清晰稳定(图3)，故仍选做核心引物。

图2 引物CB10347的等位变异带型图 Figure 2 banding patterns of the primer CB10347 for each allele

图3 引物CB10057两个位点的带型 Figure 3 banding patterns of primer CB10057 at two loci

1.2参试品种的聚类分析
参加2008-2009、2009-2010和2010-2011年度DUS测试的品种及其近似品种共55份，采用该套引物对上述品种进行聚类(图4)。由图4可知，在相似系数为0.93时可把所有参试品种区分开，同一育种单位或地区的品种往往首先聚类一类，如，秦优10号与秦油8号、油研1707与油研10号和油研11、蓉油系列(蓉油12, 蓉油11, 蓉油14, 蓉油16和蓉油15)、绵油328与绵油15、万油25与万油23、沣油系列(沣油737, 沣油5103, 沣油730和沣油520)，这些品种的相似系数分布在0.84~0.93之间，其中蓉油11和蓉油14的相似系数达到0.93。

图4 参试材料聚类图(品种代码见表4) Figure 4 Cluster of the tested accessions (the accession codes were the same as those listed in table 3)

在相似系数为0.80时，所有参试品种划分为七个相似群(图4)。W601B为不育系，单独聚为A相似群。B相似群包括2份品种，来源于陕西省咸阳市农业科学研究所，秦优10号为2008年的参试品种，秦油8号作为秦优10号的近似品种提供。C相似群包括34份品种，占所有材料的63.0%，该相似群品种的来源比较广泛，主要由四川、贵州、重庆和湖北等地选育的品种组成，特别是来源于四川和重庆的品种，占该相似群总品种数的64.7%。D相似群共有8份品种，其中7份由贵州选育，6份为贵州省油料研究所选育，且具有较近的亲缘关系。E相似群包括6份品种，其中湖南省农业科学院作物研究所的品种4份、江西省农业科学院作物研究所的品种2份。F相似群包括黔黄油21号和浙双72两份品种。蓉油3号单独构成G相似群，与其它品种的相似系数在0.74~0.80之间。

将任意一个品种视为待测品种，其余品种视为与之比较的已知品种，计算品种间的遗传相似系数，任一品种与其它品种间的遗传相似系数最大值见表2。如果分别以遗传相似系数0.95、0.90、0.85和0.80为阈值确定近似品种，那么近似品种的比例分别为0、10%、76%和94%。由此可见，随着遗传相似系数的降低，近似品种的比例迅速增加。

表2 品种间的最大遗传相似系数 Table 2 Maximum genetic similarity coefficient among varieties by pairwise comparison

1.3系谱分析与聚类结果的一致性
选择已知系谱的14份甘蓝型油菜品种(表3)，利用该套核心引物对其进行聚类分析。从图5可以看出，在遗传相似系数为0.82时，14份品种可分为5大类。

表3 用于核心引物验证的试验材料及系谱 Table3 Pedigree and the tested accessions used for validation of core primers

图5 核心引物验证材料的聚类结果 Figure 5 Cluster of the tested accessions generated by the validated core primers

A类2份品种来自陕西省咸阳市农业科学研究所，具有共同的亲本5009C。B类4份品种来自四川省成都市第二农科所，具有共同亲本蓉A0464。C类2份品种来自重庆三峡农业科学研究所，具有共同的亲本99R7。D类2份品种来自贵州省油菜研究所，具有共同亲本HF15。E类包括4份品种，其中沣油520和沣油5103来自湖南作物研究所，且具有共同亲本20A。赣油杂5号和R210来自江西省农业科学院作物研究所，赣油杂5号是以R210为亲本之一选育而成。聚类结果表明，具有共同亲本或遗传背景相近的品种优先聚为一类，聚类有效性验证结果与品种的系谱关系基本吻合，说明采用SSR标记筛选近似品种是可行的。

2讨论
前人研究表明，甘蓝型油菜基因组中存在大量SSR标记位点，但并非所有位点揭示的遗传多样性信息量同等丰富(沈金雄等, 2004)，因此，筛选一套带型清晰、等位变异间易于区别、多态性丰富、重复性好的核心引物用于指纹图谱研究可以事半功倍。本研究所选出引物平均PIC值为0.53，与陆光远等(2008)筛选的核心引物接近，略小于许鲲等(2008)和李海渤等(2010)的研究结果。但对于双位点引物，若只考虑多态性高的位点，本套引物的PIC值接近0.60。若参照Botstein等(1980)提出的标准，即PIC值大于0.5为高度多态性，本套核心引物的多态性比较丰富。

引物组合的区分能力是筛选近似品种的前提，如果无法将差异大的品种区分开，筛选出的近似品种数量非常庞大，将显著增加DUS测试的田间种植工作量。根据赵久然等(2003)的计算方法，组合本研究筛选出的核心引物对品种进行分析，任两个甘蓝型油菜自交系出现相同指纹图谱的概率为1.93×10^-39，任两个杂交种出现相同指纹图谱的概率为3.57×10^-66，即从理论上分析，采用该套引物区分品种，任两个品种无法区分的概率非常小。对参试品种的聚类分析也表明，在遗传相似系数为0.93时，确实能将所有参试品种区分开。由此可见，利用该套核心引物可以比较有效区分品种。

UPOV规定，一个品种必须与其他任何已知品种有明显区别才满足特异性要求，即理论上，需要考虑与所有已知品种比较，然而，由于已知品种数量庞大，在特异性审查中，很难实现申请品种与所有已知品种逐一比较。实际操作方法是将申请品种与近似品种进行比较，如果存在明显差异，即判定申请品种具备特异性。因此，近似品种关系到申请品种的命运，必须以严谨、科学的方法判断。

近似品种的选择可以通过亲缘系谱分析、DUS测试中的分组性状比较和DNA分子指纹辅助选择等方式，(藤海涛等, 2008)。通过亲缘系谱方法选择近似品种是相对可靠的，但存在一个弊端，即申请者可能不愿提供真实系谱或者故意提供错误系谱。通过DUS测试中的分组性状选择近似品种也存在两个不足：一是《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南甘蓝型油菜》中的分组性状多数为数量性状，易受环境影响。如果采用申请者在技术问卷中提供的分组性状来筛选，由于数据库中已知品种的性状描述和申请品种的性状描述在不同年份、环境下获得，表达状态会有所差异；二是增加测试周期和工作量，影响品种授权进度。而采用DNA指纹筛选方法，可以克服以上不足，只要申请者提供一定数量的样品即可。

系谱真实反映了品种之间的亲缘关系，具有共同亲本的品种，无论在SSR标记性状和表型性状上均具有相似性(Noli et al., 2008)。大量研究表明，SSR标记分析结果与系谱基本吻合(Noli et al., 2008; 李海渤等, 2010; Reid et al., 2011; 赖运平等, 2011)，是用于近似品种筛选的理想标记(王立新等, 2010; 张晗等, 2010)。本研究结果表明，同一育种单位或地区的品种往往优先聚在一起，遗传基础相近或具有共同亲本的品种优先聚为一起，与前人研究结果一致，综上结果说明，SSR标记用于甘蓝型油菜近似品种选择是可行的。

目前，国际上比较通用的做法是采用DUS测试性状筛选近似品种，部分国家正在尝试采用DNA指纹方法筛选。无论是采用哪种方法，前提是必须构建已知品种数据库。由于中国的新品种保护起步较晚，DUS测试性状数据库中的品种较少，DNA指纹数据库建设也正在进行中。随着两个数据库的建立和完善，近似品种的选择问题可以得到有效解决，有望避免近似品种不近似的现象，保证DUS测试的有效性和权威性。

3材料与方法
3.1试验材料
甘蓝型油菜品种共80份(表4)。其中26份为甘蓝型油菜测试指南中的标准品种，其余54份分别是2008-2009、2009-2010和2010-2011年度参加DUS测试的申请品种和近似品种。

表4 参试甘蓝型油菜品种名称 Table 4 Name of Rapeseed varieties used in this study

3.2 SSR标记分析及引物筛选
每份样品取50株幼嫩叶片混合，按照CTAB法提取基因组DNA (Doyle and Doyle, 1987)。选用甘蓝型油菜的952对SSR标记进行筛选。PCR反应体系总体积10 µL，含10×Buffer 1.0 µL、2.5 mmol/L dNTP 0.6 µL、10 µmol/L引物0.25 µL、5 U/µL Taq DNA聚合酶0.1 µL、25 mmol/L MgCl₂ 1.5 µL、10 ng/µL模板DNA 2.0 µL和ddH₂O 5.45 µL。PCR反应程序为94℃预变性2 min，1个循环；94℃变性40 s，65℃退火30 s，72℃延伸45 s，每循环降1℃，共10个循环；94℃变性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR产物经95℃变性5 min，立即转移至冰水混合物中冷却，采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，80W恒功率电泳1.5~2.5 h，银染，数码相机拍照保存。

首先，用8个系谱差异较大且表型差异明显的自交系(白花, 浙油758, MARNOO, P194, Q93, KW-33, LINAGOLD和花叶991018)对所有引物进行初筛，选出具有多态性的引物，然后用26个自交系复筛，除评价多态性高低外，重点考察带型清晰度、等位变异间区分的难易程度和重复性。

3.3数据分析
采用NTSYS-pc, version 2.0的Qualitative data和SHAN程序计算遗传相似系数(simple matching, SM)，Tree plot程序生成聚类图(Rohlf F.J., 1998, http://www.exetersoftware.com/downloads/ntsysguide.pdf)。

按照Nei方法计算引物PIC值(Nei, 1973)：

PIC=1-∑p_2ⁱ ，其中p_i为第i等位变异的频率。

作者贡献
赖运平是本研究的实验设计和实验研究的执行人；赖运平、张浙峰、王丽容和何巧林完成数据分析，论文初稿的写作；黄维藻、张新明和堵苑苑参与实验设计，试验结果分析；余毅是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由公益性行业(农业)科技专项(200903008)资助

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