2 农业部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室, 广东省农业科学院果树研究所, 广州, 510640
*同等贡献,并列第一作者
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《分子植物育种》印刷版, 2013 年, 第 11 卷, 第 24 篇 doi: 10.3969/mpb.011.000638
收稿日期: 2013年01月21日 接受日期: 2013年03月15日 发表日期: 2013年05月06日
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香蕉枯萎病是香蕉生产中最为严重、具有毁灭性的病害之一,已成为限制世界香蕉产业可持续发展的重要难题。本文根据国内外近年来香蕉枯萎病的研究概况,综述了病原菌的分离、培养和鉴定等基本研究方法,以及病原菌的分类、进化关系和分子鉴定等研究进展,以期能为中国香蕉枯萎病研究工作者提供借鉴,尽早解决香蕉枯萎病难题。
香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc)真菌侵染香蕉根部引起的土传病害(Ploetz, 2006),19世纪80年代后期首次在澳大利亚被发现,20世纪50年代在巴拿马大面积流行,因此又被称为“巴拿马病”(Panama Disease) (Pegg et al., 1996)。至20世纪90年代以来,香蕉枯萎病已蔓延至全球各主要香蕉生产国,成为最具毁灭性的香蕉病害之一(Ploetz, 2006; Molina et al., 2009)。
近年来,香蕉枯萎病已在中国各主要产区大面积爆发和流行,已严重危及到香蕉产业的健康可持续发展(许林兵等, 2010)。其中,热带4号生理小种(tropical race 4, FocTR4)的毒性和致病力超越其他生理小种(Molina et al., 2009),中国香蕉产业主栽品种类型“香牙蕉”(Cavendish)尤其易感(魏岳荣等, 2005)。香蕉枯萎病传染性极强,难以根治,病原菌具有较强的抗逆性,在土壤中可存活30年之久,常造成大面积毁园(Ploetz, 2004; 2006),已成为限制世界香蕉产业健康发展的最重要难题之一(Molina et al., 2009),引起人们高度重视。本文就近年来香蕉枯萎病病原菌的分离、鉴定等研究方法及进化分类等方面的最新研究进展进行综述,以期为深入开展香蕉枯萎病研究提供参考。
1香蕉枯萎病病原菌的分离及培养基的选择
1.1枯萎病病原菌的分离方法
一般从发病蕉园的土壤和感病植株中分离枯萎病病原菌(Leslie and Summerell, 2006)。典型的感枯萎病植株的外部症状,包括老叶黄化并逐渐枯萎、下垂,随后黄化叶从叶柄基部掉落,假茎下部纵向开裂等(魏岳荣等, 2005)。这些症状与香蕉象甲(Banana weevil)为害和感香蕉线条病病毒(Banana streak virus)的植株外部症状类似(Rutherford and Kangire, 1998; Pillay and Tripathi, 2007),我们需要在采集样品时辨别假茎内部症状的差异。感枯萎病植株的假茎维管束组织呈微红色或深褐色(Ploetz, 2006),而象甲为害的假茎内部有明显纵横交错的虫孔、虫道(尹炯, 2010),线条病毒为害的假茎内部与正常的无明显差异(Dahal et al., 1998)。
从确诊感枯萎病的植株中分离病原菌,一般用组织分离法从感病部位的假茎维管束组织中取样。切取病区组织的大小要适宜:组织太大,带的杂菌多;组织太小,需要分离的病原菌在消毒时容易被杀死(Carlier et al., 2002)。作者所在课题组采用如下方法,分离效果较好:从感病植株假茎的病健交界处切取5~6 mm的组织,在75%酒精浸泡3~5 s,接着用0.1% HgCl2浸泡2~5 min进行组织表面消毒,用无菌水漂洗3次,再将组织放置培养基平板上培养(左存武等, 2010)。
从发病蕉园的土壤中分离病原菌时,一般需在0~20 cm的耕作层内随机多点取样,土样混合后在室内自然风干、粉碎、过筛后置于4℃~5℃恒温箱中保存备用,分离病原菌时一般采用稀释平板法(Leslie and Summerell, 2006; 景晓辉等, 2009)。分离病原菌时经常会有细菌污染,可加入抗生素或把培养基调节到酸性条件来抑制细菌的生长(Leslie and Summerell, 2006; 左存武等, 2010)。
1.2枯萎病病原菌的选择性分离培养基
病原菌的分离、纯化,关键在于选择合适的分离培养基。镰刀菌选择性分离培养基,最早由Nash和Snyder (1962)研制,其后诸多学者对该培养基进行了改进。一般是在含有蛋白胨(Peptone)等镰刀菌生长的基本营养物质中,添加抑制其他病原菌生长的物质。如经典的PPA培养基(Pentachloronitrobenzenepeptone-agar),其中添加了0.1%的五氯硝基苯(PCNB) (Leslie and Summerell, 2006)。然而,PCNB是强致癌物质,对实验操作者的健康有较大风险。Andrews和Pitt (1986)发明了一种添加低浓度抗生素的DCPA培养基(Dichloran-chloramphenicol-peptone agar),其中含有2 μg/mL的dichloran (2,6-二氯-4-硝基苯胺)和200 μg/mL的氯霉素,能快速、有效分离镰刀菌。Castellá等(1997)研制出了孔雀绿琼脂培养基(malachite green agar, MGA),其中含2.5 mg/L的孔雀石绿草酸盐,对镰刀菌的分离效果要好于Nash & Snyder培养基。Vujanovic等(2002)比较了培养基中添加的10种抑菌剂对镰刀菌筛选的效果,如PCNB、Rose Bengal (四氯四碘荧光素)、孔雀石绿草酸盐、次氯酸钠、captan (克菌丹)、benomyl (苯菌灵)、chlorotalonil (四氯间苯二腈)、myclobutanil (腈菌唑)、thiram (双硫胺甲酰)和硫酸铜,发现加入腈菌唑的MBA培养基分离镰刀菌效果最好。Nishimura (2007)研制出Fo-G1、Fo-G2琼脂培养基,其中加入了柠檬酸氢二铵、L-山梨糖、硝酸益康唑(Econazole nitrate)、25%双胍辛胺乙酸盐溶液(Iminoctadine triacetate)和50%甲基立枯磷可湿性粉剂(Tolclofos-methyl wettable powder),能从复杂土壤样品中分离获得镰刀菌。然而,上述不同类型的培养基在制作过程中需经高温灭菌,取样操作须在无菌条件下进行,并且有些培养基添加物价格较高,增加制作成本。景晓辉等(2009)研制出的PCEA (potato-cupric sulfate-ethanol-agar)培养基,通过添加CuSO4·5H2O、MgSO4·7H2O和KH2PO4来抑制杂菌且促进香蕉枯萎病菌的生长,从而达到直接从土壤和植物组织中快速分离香蕉枯萎病菌的目的。
2香蕉枯萎病病原菌的分类
2.1病原菌生理小种分类
传统上香蕉枯萎病镰刀菌的分类,是依据其侵染不同香蕉品种资源类型(寄主范围)划分的,现有3个生理小种(Races)。其中,1号生理小种(Foc Race 1)可侵染大蜜舍品种(‘Gros Michel’, AAA)。大蜜舍曾经是国际香蕉贸易中最受欢迎的品种,由于受Foc Race 1侵染引起的枯萎病严重为害而在20世纪50年代迅速退出国际市场,如今被抗Foc Race 1的香牙蕉品种(‘Cavendish’, AAA)替代(Waite and Stover, 1960)。同时,Foc Race 1还可侵染粉蕉(ABB)、Silk(AAB)和Mysore(AAB)等品种类型。4号生理小种(Race 4)不仅可侵染Foc Race 1的上述寄主,还可侵染香牙蕉品种。根据在热带和亚热带区域分离到的香牙蕉枯萎病病原菌,Race 4又可分为热带和亚热带两个亚小种(Foc STR4和Foc TR4),如在台湾、南非和澳大利亚等区域发现的为Foc STR4,在南亚和东南亚等区域发现的为Foc TR4 (Su et al., 1986; Ploetz, 2004; 2006; Ploetz and Pegg, 2000)。2号生理小种(Race 2)可侵染‘Bluggoe’(ABB)等煮食蕉类品种(Su et al., 1986)。原属于3号生理小种的菌株,目前已证实只侵染观赏类植物旅人蕉科蝎尾蕉属(Heliconia spp.),对香蕉资源和品种的致病力较弱(Waite, 1963; Ploetz, 2006)。
2.2病原菌的VCGs分类
以不同生理小种来划分枯萎病病原菌,仅代表寄主与病原间关系,有其局限性,不能反映不同菌系间的遗传关系和变异性。体细胞亲和性(Somatic compatibility)被用来鉴定香蕉枯萎病原菌群体的遗传进化关系,通过在硝酸盐利用营养缺陷型突变体(Nitrate-non-utilizing auxotrophic mutants)中异核体形成的不同来鉴定不同的营养体亲和群(vegetative compatibility groups, VCGs) (Puhalla, 1985; Ploetz and Correll, 1988)。迄今尖孢镰刀菌鉴定出30多种专化型、140多个VCGs,为便于研究和交流方便,不同专化型用3位数字表示,专化型内的亲和群则在3位代码后依次用1位或者多位数来表示(Puhalla, 1985)。如,侵染香蕉的古巴专化型代码为012-,VCGs编号为0120~0126、0128~01224。迄今根据24个标准的VCG testers,鉴定出27个VCGs (Bentley et al., 1995; Fourie et al., 2009) (表1)。如,Foc STR4的VCGs有0120、0121、0122、0129和01211,Foc TR4的VCGs有01213、01216和01213/01216。值得注意的是,多个生理小种可能同处一个VCG中,一个小种也可能同时发现多个VCGs,如0124、0125和01212都属于Race 1和Race 2。目前关于中国境内香蕉枯萎病病原菌VCGs分析方面尚无公开报道。本研究在中国蕉区采集100余份样本,已鉴定出11种VCGs,大部分为Foc STR4和Foc TR4;此外,我们还从大蕉中分离、鉴定出一种新的香蕉枯病病原菌VCG (李春雨等, 2013, 私人通讯)。
表1 香蕉枯萎病病原菌VCGs编号, 分类及其寄主来源信息a
Table 1 Vegetative compatibility groups (VCGs), races, phylogenetic analysis and origins of strains of Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FOC) and the host varieties a |
2.3病原菌的进化关系
O'Donnell等(1998)通过对尖孢镰刀菌不同专化型菌株的线粒体和核基因组DNA序列进行比较分析,首次对香蕉枯萎病病原菌的系统进化进行了研究,发现古巴专化型病原菌有不同的进化起源。国内多数学者基于不同生理小种进行的分析,也有类似的观点(谢艺贤等, 2005; 廖林凤等, 2009; 李春雨等, 2011)。Fourie等(2009)对全球范围内收集的70株香蕉根际存在的尖孢镰刀菌菌株(包括20个致病性古巴专化型VCGs和其他非致病性专化型)进行了系统进化分析,发现VCGs可分为2个进化枝(clade A和B)和8个谱系(lineageⅠ-Ⅷ),其中1号和4号生理小种在2个进化枝的不同谱系中均有分布。聚类在clade B的大部分VCGs可侵染含B基因组的香蕉品种资源(如AAB或ABB类型),而聚类在clade A的VCGs侵染只含A基因组的香蕉品种资源(如AAA类型) (表1)。这些结果不仅充分印证了香蕉枯萎病病原菌的多进化起源观点,而且还说明病原菌和寄主植物的共进化(Coevoluation)是导致多进化起源的重要原因(Fourie et al., 2009)。香蕉遗传背景较复杂,其种质资源多样性和进化中心位于印度-马来亚区域(Wallace's indo-malayan region),该地区同样也可能是尖孢镰刀菌古巴专化型VCGs的进化中心(Ploetz and Pegg, 1997)。此外,Fourie等(2009)根据rDNA-IGS间区序列的系统进化树不同VCGs的聚类结果,建立了利用PCR-RFLP分子标记鉴别不同VCGs的快速方法,可部分替代依赖于24个标准VCG testers的传统VCGs鉴定方法。
3香蕉枯萎病病原菌的检测和鉴定
3.1病原菌形态学鉴定
香蕉枯萎病病原菌有3种孢子形态,分别为卵圆形的小型分生孢子、呈镰刀形的大型分生孢子和球形或椭圆形的厚垣孢子。经典的鉴别病原菌形态的方法,一般是将分离到的病原菌放置在CLA培养基(Carnation leaf agar)上培养。培养数天后,可发现大量的小型分生孢子、无或极少量的大型分生孢子以及培养4~6个星期后形成的厚垣孢子(Leslie and Summerell, 2006; Fourie et al., 2009; 曾丽莎, 2011)。不同VCGs菌株在CLA培养基上的生长速率无明显差异,但不同孢子形态的比例会有所不同,如VCG 0126、01210和01219菌株的小型分生孢子数量相比其他VCGs菌株偏少,而大型分生孢子数量偏多(Fourie et al., 2009)。病原菌在不同培养基上培养,其性状和生长状况会有所不同。如,林妃等(2010)从海南分离的1号和4号生理小种,在PDA培养基(Pa- totao dextrose agar)中菌丝体分别呈淡粉白色和白色,在Komada改良培养基上菌丝体分别呈白色和黄色。此外,中国学者发现,培养基上1号生理小种菌落的边缘圆形无齿状物,而4号生理小种有齿状物,此特征可用来鉴别这两个生理小种(陈静华和张绍升, 2008; 林妃等, 2010)。
3.2病原菌/VCGs的分子标记检测
分子标记技术来鉴定和区分香蕉枯萎病的不同病原菌,具有简便、快速和高效等优点。王文华和曾会才(2007)发现尖孢镰刀菌不同专化型在其核糖体RNA基因内转录间隔区(ITS)区段序列上差异性较小,不适合区分不同专化型及生理小种,但香蕉枯萎病4号生理小种的ITS序列在367 bp和386 bp位点上与1号生理小种及其他尖孢镰刀菌专化型的ITS序列相同位点上存在差异。吕伟成等(2009)利用这些ITS序列位点上的差异,进一步建立了一种基于ITS-SCAR的一步双重PCR方法,能同时检测1号和4号生理小种。Dita等(2010)利用不同VCGs的IGS上两个SNP位点上的多态性,可以从不同VCGs中区分出TR4 VCG 01213 (463 bp的特异性条带),而且可作为对感病植株的分子标记检测。
台湾地区学者Lin等(2009)利用RAPD分子标记技术,从随机引物OP-A02扩增出的242 bp特异条带序列中开发出Foc-1/Foc-2标记引物,可有效鉴定出台湾存在的香蕉枯萎病4号生理小种(包括Foc STR4和Foc TR4 VCGs)。接着,Lin等(2013)又从242 bp的RAPD扩增产物中,开发出了灵敏度更高、更稳定的SCAR标记引物FocSc-1/FocSc-2,可结合real-time PCR定量技术估测枯萎病感病程度。中国大陆学者也成功建立了以SCAR标记为基础的香蕉枯萎病病原菌快速检测技术。例如,刘景梅等(2006)筛选出检测1号生理小种的SACR标记1个,检测4号生理小种的SCAR标记2个,能同时检测这两个生理小种的SCAR标记1个。廖林凤等(2009)也成功筛选到能特异检测4号生理小种的SCAR标记1个。
4总结和展望
香蕉枯萎病危害性极大,迄今还没有有效的防控措施。只有种植抗性品种才能最终有效解决此问题,然而目前全世界还未有一个理想的抗病品种。由于病原菌-尖孢镰刀菌古巴专化型比其它尖孢镰刀菌专化型具有更丰富的遗传多样性、多进化起源等特点,且进化速度有加快的趋势,原有的几个抗病品种的抗性正在逐步丧失,所以研究香蕉枯萎病相比其他作物的枯萎病病害更为复杂、难度更大。因而,抗病育种工作需要深入地了解病原菌的生物多样性、进化规律、致病机理。镰刀菌属比较基因组数据库和古巴专化种基因组数据已公布(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_group/GenomesIndex.html/) (Ma et al., 2010),香蕉基因组也已测序并公布(D'Hont et al., 2012; 刘菊华等, 2012)。因此,下一步可对代表性香蕉枯萎病VCGs进行全基因组测序和重测序,研究VCGs系统进化史,深入了解寄主和病原互作的机制,并进行VCGs间基因组序列、结构变异与寄主专一性的关联分析。
中国香蕉枯萎病研究起步较晚,研究力量较薄弱,研究系统性不强,现在国内大多学者还是基于不同省域存在的病原菌生理小种基础上开展研究(廖林凤等, 2009; 林妃等, 2010; 张欣等, 2012)。依据生理小种研究香蕉枯萎病致病性及致病机制,有其明显局限性。因此,对中国境内的香蕉枯萎病病原菌种类以及VCGs开展全面协作研究非常必要且意义重大。鉴于香蕉枯萎病病原菌是检疫性病原,无法引进标准VCG testers鉴定VCGs种类,因此可采用IGS- PCR-RFLP分子标记技术进行鉴定。然后,可利用比较转录组学和蛋白组学方法研究不同VCGs 菌株与其相应的抗感病资源的互作机理,鉴定特征效应蛋白和克隆抗病相关基因。此外,需要加大种质资源抗病性评价力度,从中筛选出高抗资源,解析其抗病机制,进行种质创新(胡春华等, 2010a; 2010b)。
作者贡献
李斌和盛鸥是本研究的实验设计和实验研究的执行人,完成论文初稿写作并参与论文修改及定稿;李春雨、魏岳荣、左存武和胡春华参与论文讨论及论文的修改;易干军和罗充是综述的构思者及负责人,指导论文的写作、修改及定稿。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目(U1131004, 31101510)、珠江科技新星专项(2013J22000881)、国家863计划项目(2011AA10020603)、科技部国际合作专项(2013DFB30400)、国家948计划项目(2011-G16)、国家香蕉产业技术体系建设项目(CARS-32-01)、广东省现代农业产业技术体系专项(lnsgtx-03)和广东省农业科学院院长基金项目(201112)共同资助。
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