花粉管通道法是授粉后使外源DNA沿着植物受精过程形成的花粉管通道进行渗透，经过珠心进入胚囊，最终转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。该方法已经应用于棉花、水稻、大豆及玉米等多种作物中并取得成功(Zhou et al., 1983; 严成其等, 1997; Gong et al., 1988; 赵凌等, 2006; 武小霞等, 2010; 李志亮等, 2010)。由于对花粉管通道转导的途径缺乏确切的认识，致使实验人员对于如何利用花粉管通道法进行遗传转化没有一个统一而规范的操作规程。这不但增加了试验的盲目性和误差，也大大降低了花粉管通道技术的遗传转化效率。免疫组织化学技术(Immunohistochemistry, IHC)在生物医学研究和临床病理学、微生物学诊断中显示出巨大的实用价值，该技术多应用于动物组织细胞(杨磊等, 2011)和药用植物的研究(武振华等, 2005)。本研究将该技术应用于番茄花粉管通道遗传转化途径的研究中，通过对番茄花粉管通道法遗传转化途径中外源DNA在花柱和子房中的具体行进路线，以及对外源DNA穿梭花柱后进入子房的时间范围进行研究，以期为阐述花粉管通道遗传转化法的机理奠定基础，从而可以制定出番茄等经济作物的花粉管通道遗传转化的基本操作规程，这将有助于花粉管通道技术在转基因植物育种和分子农业领域中更加广泛的应用。

1结果与分析
1.1花粉管通道法遗传转化途径的观察
利用免疫组织化学技术对番茄花柱和子房中的外源基因进行定位，选择未导入P4IL4质粒-探针杂交体也未进行免疫组化显色处理的试材切片为空白对照，观察发现切片标本呈正常的爱式苏木精染液染色反应，没有棕黄色的细胞或组织出现(图1A; 图1B)。

图1 免疫组织化学技术对番茄花柱和子房中的外源基因定位 注: A: 番茄子房爱氏苏木精染液染色×400; B: 番茄花柱爱氏苏木精染液染色×200; C: 番茄花柱内源性干扰信号×200; D: 番茄胚珠内源性干扰信号×400; E: 番茄花柱中的阳性信号和干扰信号×200; F: 番茄花柱中的阳性信号和干扰信号×200; a: 干扰信号; b: 阳性信号 Figure 1 Gene location in style and ovary of tomato by Immuno- histochemistry Note: A: The tomato ovary stained by Ehrlich's haematoxylin ×400; B: The tomato style stained by Ehrlich's haematoxylin ×200; C: Endogenous interference signals in tomato style ×200; D: Endogenous interference signals in tomato ovule ×400; E: Positive signal and interference signal in tomato style ×200; F: Positive signal and interference signal in tomato style ×200; a: Interference signal; b: Positive signal

以未导入P4IL4质粒-探针杂交体的试材切片，进行免疫组化显色和苏木精染色作为对照，常规封片后在光镜下观察，花柱和子房切片上出现了分散的棕黄色颗粒(图1C; 图1D)，表明免疫组化显色时出现了干扰信号，可能由于植物材料内源性物质存在的原因。

将导入P4IL4质粒-探针杂交体的试材切片，进行免疫组化显色和苏木精染色，常规封片。光镜下观察发现，切片上棕黄色信号明显比对照面积大，数目多，且能明显与对照中内源性物质的干扰信号相区别(图1E; 图1F)。

在番茄人工授粉24 h后切除柱头，并在切口处滴加P4IL4质粒-探针杂交体进行转化操作(处理Ⅰ)，定期取样，光镜下观察到外源基因在番茄花柱与子房中的运行过程大致如下：转化后约30 min，P4IL4质粒-探针杂交体从花柱切口处向引导组织中移动753.554±52.603 μm (图2A)；转化后约10 h，P4IL4质粒-探针杂交体已通过花柱引导组织，到达花柱与子房连接处附近(图2B)；转化后约26 h，P4IL4质粒-探针杂交体进入番茄子房的中轴胎座，少数P4IL4质粒-探针杂交体已通过中轴胎座，到达胚珠的珠柄处(图2D-图2I)；转化后26~36 h，大多数P4IL4质粒-探针杂交体是从珠柄维管束外侧，也就是珠被的一侧进入胚囊(图2J; 图2K)。

图2 处理Ⅰ中外源基因在番茄花柱与子房中的运行过程 注: A: 转化后约30 min, 番茄花柱中出现阳性信号×50; B: 转化后约10 h, 阳性信号到达番茄花柱与子房连接处附近×100; C:转化后约1 h, 番茄花柱有阳性信号×100; D: 转化后约26 h, 阳性信号到达番茄子房的胎座中×400; E: 转化后约26 h, 阳性信号到达番茄子房的胎座中×200; F: 转化后约26 h, 阳性信号到达番茄子房的胎座中×400; G: 转化后约26 h, 阳性信号到达番茄子房的胎座和胚珠的珠柄处×200; H: 转化后约26 h, 阳性信号到达番茄子房胚珠的珠柄处×400; I: 转化后约26 h, 阳性信号到达番茄子房胚珠的珠柄处×200; J: 转化后约26 h, 阳性信号到达番茄子房胚珠的珠柄处×100; K: 番茄子房胚囊内的阳性信号和干扰信号×400; a: 干扰信号; b: 阳性信号 Figure 2 Procedure of gene in style and ovary of tomato in treatment Ⅰ Note: A: Transformed after 30 min, positive signal in the tomato style ×50; B: Transformed after 10 h, positive signals reach the junction of tomato style and ovary ×100; C: Transformed after 1 h, positive signal appeared in tomato style ×100; D: Transformed after 26 h, positive signal reached the tomato ovary placentation ×400; E: Transformed after 26 h, positive signal reached the tomato ovary placentation ×200; F: Transformed after 26 h, positive signal reached the tomato ovary placentation ×400; G: Transformed after 26 h, positive signal reached the tomato ovary placenta and ovule funiculus ×200; H: Transformed after 26 h, positive signal reached the tomato ovary ovule funiculus ×400; I: Transformed after 26 h, positive signal reached the tomato ovary ovule funiculus ×200; J: Transformed after 26 h, positive signal reaches the tomato ovary ovule funiculus ×100; K: Positive signal and interference signal in the tomato ovary embryo sac ×400; a: Interference signal; b: Positive signal

在番茄人工授粉12 h后切除柱头，并在切口处滴加P4IL4质粒-探针杂交体进行转化操作(处理Ⅱ)，定期取样，光镜下观察到外源基因在番茄花柱与子房中的运行过程如下：转化后约3 h，P4IL4质粒-探针杂交体从花柱切口处向引导组织中移动约1 221.587 μm (图3A)。转化后12~38 h，P4IL4质粒-探针杂交体已通过中轴胎座，到达胚珠的珠柄处(图3B; 图3C)。

图3 处理Ⅱ中外源基因在番茄花柱与子房中的运行过程 注: A: 转化后约3 h, 番茄花柱中出现阳性信号×100; B: 转化后约12 h后, 番茄子房胚珠的珠柄中出现阳性信号×400; C: 转化后约28 h, 番茄子房胚珠的珠柄中出现阳性信号(用蛋清液封闭番茄胚珠内源性生物素)×400; a: 干扰信号; b: 阳性信号 Figure 3 Procedure of gene in style and ovary of tomato in treatment Ⅱ Note: A: Transformed after 3 h, positive signal in the tomato style ×100; B: Transformed after 12 h, positive signal appeared in the tomato ovary ovule funiculus ×400; C: Transformed after 28 h, positive signal appeared in the tomato ovary ovule funiculus (tomato ovule endogenous biotin was closed with egg white) ×400; a: Interference signal; b: Positive signal

根据Ⅰ、Ⅱ两个处理花柱与子房组织切片免疫组化显色后所观察到的现象，推断P4IL4质粒-探针杂交体导入番茄的大致途径为转化后约10 h通过花柱引导组织进入子房，转化后12~38 h，P4IL4质粒-探针杂交体经过中轴胎座、胚珠珠柄到达胚囊。

1.2 P4IL4质粒-探针杂交体的移动速度
在番茄人工授粉24 h后用锋利刀片切除柱头，滴加P4IL4质粒-探针杂交体(处理Ⅰ)。转化后约30 min，取材，固定，制作石蜡切片，免疫组化显色后在光镜下观察，P4IL4质粒-探针杂交体在3个花柱材料中移动距离分别是721.335±37.981 μm、756.983± 52.864 μm和814.563±10.146 μm (图2A)，P4IL4质粒-探针杂交体在花柱中的移动速度约为1.507±0.105 mm/h，番茄花柱的长度一般约为7~8 mm，据此计算得出P4IL4质粒-探针杂交体通过花柱的时间约为4.5 h。

在研究中观测到，授粉24 h后进行转化操作的处理，在转化后约10 h P4IL4质粒-探针杂交体到达花柱与子房连接处附近(图2B)。由此可知，P4IL4质粒-探针杂交体随花柱组织吸附损耗和引导组织内的阻力，移动速度逐渐减慢。

在对转化后约1 h (处理Ⅰ)的花柱材料镜检时发现，花柱中P4IL4质粒-探针杂交体移动距离约是171.92 μm (图2C)，其数值明显低于转化后约30 min P4IL4质粒-探针杂交体的移动距离。分析预计在柱头的切口上滴加P4IL4质粒-探针杂交体后，如果液滴很快脱落，进入花柱中的外源基因的量就会大为减少，其移动的速度会相应减慢。

2讨论
2.1植物材料中内源物质对免疫组化显色的干扰
胚珠珠被的表皮细胞中聚集了许多生理活性物质，如氧化酶类(多酚氧化酶, 细胞色素氧化酶, 过氧化物酶等)、硫氢基化合物、抗坏血酸异生长素和氨基酸等。胚囊氧化酶的活性一般很高，反足细胞内过氧化物酶非常多，这和反足细胞的吸器机能有关。番茄和大白菜的反足细胞不发达，由珠被绒毡层来分泌酶吸收养料。在胚珠发育的最初阶段，珠心过氧化物酶活性很高(赵世绪, 1982)。植物材料还含有大量的内源性生物素，导致免疫组化时产生干扰信号，影响检测的特异性。

 在进行免疫组化染色中，本研究选择的抗体是用过氧化物酶来标记的，酶的作用是催化底物，使显色剂显色。而番茄和白菜花柱和胚珠中的内源性酶同样也能催化底物，使其显色，这就影响了免疫组化的特异性，这种影响在胚珠中尤为明显，由于进入胚囊的P4IL4质粒-探针杂交体很少，阳性信号很弱，胚珠珠心和珠被中含有大量的氧化酶类和生物素，在光镜下有时很难将阳性信号与干扰信号相区别(图2H; 图2K; 图3B)，因此在判断胚囊中的信号是外源基因还是内源性干扰物质时要十分慎重。

2.2 P4IL4质粒-探针杂交体导入途径
用锋利刀片将花柱横向切断后，滴加P4IL4质粒-探针杂交体，此时滴加在断口上的P4IL4质粒-探针杂交体可以被断面上的任何细胞和组织吸附，其中也有花粉管及其所形成的通道，如果P4IL4质粒-探针杂交体沿通道进入胚囊参与受精，遗传转化就可能发生。

 在光镜下观察到导管中也有信号出现(图2J)。如果导管中的信号是阳性信号，则表明花柱被横向切断后，滴加的一部分P4IL4质粒-探针杂交体可能进入切面上的导管分子。对于进入导管中的P4IL4质粒-探针杂交体能否进入胚囊参与受精进行遗传转化，导管分子是否是花粉管通道途径以外的外源基因进入胚囊的途径，还有待进一步的研究。

 按一般的规律，通过珠柄进入胚珠的维管束止于合点处。维管束在胚珠中的敷设，是母体与子代之间水分和营养联系的一个重要途径(胡适宜, 2005)。在光镜下可以看到，大多数P4IL4质粒-探针杂交体是从珠柄维管束外侧，也就是珠被的一侧进入胚囊(图2G-图2J; 图3B)。分析可能是珠被细胞较珠心细胞排列的疏松，所以P4IL4质粒-探针杂交体更容易进入到珠被中。

2.3番茄花粉管通道法转化的适宜时期
花粉管通道法的转化操作应处于花粉管通道形成之后的精卵融合至合子分裂前这段时期(王艳杰和申家恒, 2006)。若导入时间过早，花粉管的数量较少，且还未伸长或未到达胚珠，此时外源基因无法进入胚囊，滞留在组织间隙中，如果外源基因滞留时间较长，则容易降解，会大大降低转化效率；若导入时间过晚，一方面胚胎已形成，珠心组织呈封闭状态，外源基因很难进入，另一方面即使外源基因进入胚囊，却不能保证其转化单细胞的生殖细胞，如果转化二细胞原胚，则可能形成嵌合体，进入的外源基因就会在其后代中发生分离或者丢失。所以对花粉管通道法转化的后代进行遗传学分析常会有不符合孟德尔定律的报道，也说明了这种可能的存在(刘明等, 2007)。

对授粉后24 h进行转化(处理Ⅰ)和授粉后12 h (处理Ⅱ)进行转化的番茄子房材料制片后进行免疫组化显色处理，处理Ⅰ授粉后26~34 h (即转化后2~ 10 h)，P4IL4质粒-探针杂交体经中轴胎座、胚珠珠柄到达胚囊；处理Ⅱ授粉后14~20 h (即转化后2~ 8 h)，P4IL4质粒-探针杂交体经中轴胎座、胚珠珠柄到达胚囊。

王秋红和申家恒(2005)对番茄受精作用及其间隔期研究结果表明，番茄花粉管延伸到胚珠约是授粉后18~24 h，约26 h，一个精子贴伏于卵细胞膜上，30 h精核进入卵细胞，精卵融合形成合子约是授粉后34~50 h。本研究认为花粉管通道法转化番茄的适宜时期为精卵融合至合子分裂前这段时期，因此应在授粉后24 h进行切除整个番茄花柱的转化操作。

3材料与方法
3.1实验材料
番茄(Solanum lycopersicum Mill.)品种为“金棚”，来源于哈尔滨市农业科学院，种植于哈尔滨师范大学生命科学与技术学院的农园。

3.2探针制备
天津灏洋生物公司设计3条地高辛标记的DNA探针，将这3条探针与本实验室构建的P4IL4质粒载体杂交，形成质粒-探针杂交复合体，以备遗传转化之用(图4)。

图4 P4IL4质粒载体 Figure 4 P4IL4 plasmid vector

番茄的雌蕊在花药开裂前两天就具有受精能力，在开花前日进行蕾期授粉。人工授粉后，在相应的花柄上挂牌注明授粉的时间和日期，为遗传转化操作做好准备。

3.3转化方法
番茄转化方法及转化方案：用锋利的刀片切除番茄花的整个花柱，然后用微量移液器在其切口处滴加5 μL含外源基因载体的溶液，溶液浓度为1 μg/μL。滴加外源基因载体液滴后，在相应的花柄上挂牌注明滴加的时间和日期。

本研究实施处理Ⅰ、Ⅱ两种转化方法，具体内容如下：处理Ⅰ：授粉后24 h切除番茄花柱，并在切口处滴加外源基因载体，使其在柱头上形成1个液滴；处理Ⅱ：授粉后12 h切除番茄花柱，并在切口处滴加外源基因载体，使其在柱头上形成1个液滴。

番茄的固定与保存：处理Ⅰ：转化后每隔30 min取材，取材2次，取到转化后1 h；然后，每隔1 h取材，取材3次，取到转化后4 h；之后在转化后6 h、10 h和16 h各取材1次；最后每隔10 h取材，取材2次，取到转化后36 h。处理Ⅱ：转化后每隔30 min取材，取材2次，取到转化后1 h；然后，每隔1 h取材，取材3次，取到转化后4 h；然后，每隔2 h取材，取材7次，取到转化后18 h；转化后22 h和28 h各取材1次；最后每隔10 h取材，取材2次，取到转化后48 h。

转化操作后，定时取材(每次取3朵花)。采用卡诺固定液固定2 h，70%乙醇4℃冰箱保存。利用常规石蜡切片法染色，镜检，蓝化和脱水制成切片后，经脱蜡复水，滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，加入高敏过氧化物酶链亲和素复合物工作液，DAB显色，苏木素复染，切片脱水、透明、封片。

作者贡献
李婉婷是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；金晓霞指导论文撰写与修改，并最终定稿；于丽杰是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11511122)资助。

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