‘Sorbonne’ (Lilium oriental ‘Sorbonne’)是东方百合的一个主栽品种，为百合科百合属多年生球根花卉，是重要的观赏花卉，然而其种球依靠进口，生产成本高，病虫害严重，耐阴性差，花朵数少(蔡宣梅等, 2006)。随着人们生活水平的提高，百合花卉市场的需求不断增长，并逐渐多样化，人们迫切需要更多更好的百合新品种来代替原有品种，因此，百合的遗传改良是百合花卉产业发展的重要内容(赵祥云等, 2000, 中国农业出版社, pp.1-80)。

云南野生大百合为百合科大百合属球根花卉，其抗性强，花型和株型好，花朵数多，花色单一(关文灵等, 2003, 北方园艺, (4): 33)。东方百合‘Sorbonne’与云南野生大百合的杂交品种培育，不仅可以综合它们间的优缺点，而且可培育出具有中国特色的，有自主知识产权百合新品种。东方百合与云南大百合杂交为属间远源杂交，导致杂交不亲和或杂种不育，给杂交育种新品种培育带来极大障碍，然而，植物原生质体融合技术可以克服远源杂交障碍，同时，植物原生质体分离、培养及植株再生技术是进行植物育种、基因工程、遗传理论及细胞生理生化特性研究的平台，具有重要的研究意义(张颖等, 2010)。

本研究以‘Sorbonne’花托诱导的愈伤组织为材料，制备原生质体、对其活性及再生细胞分裂进行研究，为下一步远源杂交新品种的培育奠定基础。

1结果与分析
1.1胚性愈伤组织的诱导
以花托为外植体，培养基为MS+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，成功诱导出丛生芽，增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，成功诱导出叶片和小鳞茎。以叶柄和小鳞片为外植体，优化激素6-BA和Picloram的配方，诱导胚性愈伤组织。从表1可见，以鳞片为外植体，所有处理均未获得愈伤组织；以叶柄为外植体，接种7 d后，处理1、2和3叶柄没有膨大，而处理4、5、6、7、8和9叶柄基部膨大；接种30 d后，处理1、2和3叶柄长出愈伤组织(图1A)，处理4、5、6、7、8和9叶柄基部继续膨大，但不具备愈伤组织的特征。接种50 d后，处理1、2和3叶柄均诱导出愈伤组织(图1A)，并拥有大量丛生芽(图1B)；处理2愈伤组织中含有少量丛生芽；处理3的愈伤组织呈黄白色，紧实，易碎、活性强，符合胚性愈伤组织的特点(王杰等, 2008)并且无丛生芽产生(图1C)。处理4、5和6的叶柄外植体均长为丛生芽，无愈伤组织，处理7、8和9的叶柄分化差。因此，为获得高质量胚性愈伤组织，MS+Picloram 3 mg/L为最优培养基。

表1 不同激素组配对诱导胚性愈伤组织的影响 Table 1 Effects of different hormone combination on induction of embryonic callus

图1 ‘Sorbonne’愈伤组织与原生质体 注: A: 叶柄诱导的愈伤组织; B: 愈伤组织与芽混生; C: 胚性愈伤组织; D: FDA染色鉴定原生质体活性(发荧光的为活力旺盛的原生质体); E: 原生质体显微图; F: 原生质体再生细胞壁; G: 第一次分裂的细胞; H: 再生细胞团 Figure 1 The callus and protoplasts of ‘Sorbonne’ Note: A: Callus induction from petiole; B: Callus with shoot tip; C: Embryonic callus; D: FDA identification of protoplast vitality (fluorescigenic cell means protoplast with hearty vitality); E: Protoplast micrograph; F: Protoplast regenerating cell wall; G: The first division of cells; H: Regenerative cell mass

1.2裂解酶的裂解时间对胚性愈伤组织原生质体分离的影响
由表2可见，‘Sorbonne’胚性愈伤组织在裂解酶(孙晓梅等, 2007)作用下，黑暗中酶解4 h，原生质体产量为0；酶解12 h时，原生质体产量达到最大，为4×10⁵个/mL，活性达52%；在酶解时间为14 h时，原生质体产量降低，活性增强。在酶解时间为16 h，原生质体产量和活性都降低。因此，在产量和活性都兼顾的情况下，最好的酶解时间为12 h。

表2 裂解酶的裂解时间对提取原生质体的产量和活性的影响 Table 2 Effect of enzymolysis time on yield and activity of protoplasts

1.3胚性愈伤组织原生质体培养
以诱导胚性愈伤组织的培养基MS*+Picloram 3 mg/L为原生质体培养的培养基，分别利用悬滴培养、液体培养、固体培养、固液结合培养和看护培养5种方法，进行原生质体培养，筛选最佳培养基；结果表明，在悬滴培养、液体培养、固体培养、固液结合培养4种方法中均未在显微镜下观察到原生质体的分裂，但在看护培养中观察到长细胞壁的原生质体；以看护培养为原生质体的培养方法，在不同培养基中进行培养，筛选最佳培养基配方。从表3可见，在MS*+Picloram 2 mg/L的培养基中培养2~3 d时，可在显微镜下观察到长细胞壁的原生质体(图1F)，培养4~6 d，可见原生质体的第一次分裂(图1G)，培养40~45 d，观察到原生质体分化成的细胞团(图1H)。其它培养基培养后均未见到原生质体形成的细胞团。

表3 看护培养不同激素对原生质体培养的影响 Table 3 Effect of the nurse culture's different culture medium on protoplast culture

2讨论
原生质体的游离是原生质体培养成功的一个重要环节。目前，游离植物原生质体的常规方法是酶解法，用酶解法游离原生质体时，选择适宜材料是分离培养原生质体成功与否的关键因素。大多数植物从愈伤组织中分离得到的原生质体产量和活性远远高于从其它组织器官中获得的原生质体，而且分离的原生质体较易培养(王娟等, 2010; 王杰等, 2008; Profumo et al., 1987)。因此，本研究建立了‘Sorbonne’愈伤组织培养的再生系统，并以愈伤组织为材料成功分离了东方百合‘Sorbonne’的原生质体。其次，要选择合适的水解酶种类、组合及浓度。此外，还必须控制好酶解条件，影响酶解过程的主要因素有温度、pH值、渗透压、离子浓度和振荡及预处理等，孙晓梅等(2007)获得了‘Sorbonne’原生质体，但对原生质体的活性没有报导，而且所采用的培养基和液体浅层培养法培养原生质体未得到好的效果。经过实验研究，本研究在孙晓梅等(2007)的酶的组合及浓度的基础上，认为分离原生质体时酶的裂解时间为12 h，对原生质体的产量和活性最好，与孙晓梅研究结果不一致。另外，本研究在胚性愈伤组织诱导时发现选用picloram代替2,4-D做为外源激素，可以很容易获得高质量胚性愈伤组织，而且水渍化减少，利于原生质体的分离。

原生质体培养再生植株是细胞融合、体细胞杂交的基础，受到很多因素的影响(Pan et al., 2003; 2006)。原生质体的植株再生途径通常有3条：①经细胞团发育形成愈伤组织,再分化成芽长成植株；②直接形成胚状体，再发育成植株；③先形成愈伤组织，再由愈伤组织分化形成胚状体，最后发育成植株。而且，分化和再生所需培养基的营养成分一般与同种植物正常离体组织培养的要求相似(李杰等, 2003)，因此，百合‘Sorbonne’原生质体培养时本研究采用诱导胚性愈伤组织的培养基，经过悬滴培养、液体培养、固体培养、固液结合培养和看护培养5种培养方法的筛选，最后发现看护培养效果较好，再在看护培养的基础上，调整培养基的配方和培养条件，获得原生质体再生细胞团，但最终还是没能分化为愈伤组织。植物分化和植株再生能力受供体植物的染色体组型和基因型影响，甚至同一品种的不同个体之间也表现出这样的差异(Horita et al., 2002)。为获得百合‘Sorbonne’原生质体再生植物，培养基配方和培养条件等因素还需进一步探索。

3材料与方法
3.1材料
以荷兰进口的东方百合品种‘Sorbonne’花托为外植体，诱导丛生芽和小鳞片，再诱导胚性愈伤组织。

3.2方法
3.2.1胚性愈伤组织的诱导
首先，外植体用自来水冲洗3次，然后用75%的酒精浸泡30 s，再用0.1%的升汞消毒5 min，无菌水冲洗3~4次，将消毒后的花托接种在MS+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA培养基上，诱导丛生芽；增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，诱导叶片和小鳞茎(刘雅莉等, 2004)。再以诱导出的丛生芽的细嫩叶柄和小鳞片为外植体，在MS为基本培养基，附加不同浓度的6-BA、NAA和picloram (mg/L)，3%蔗糖，0.7%琼脂，pH为5.8的诱导培养基上进行胚性愈伤组织诱导，培养条件为温度25℃，暗培养。

3.2.2原生质体的提取和活性鉴定
挑选上述继代后生长状态良好的愈伤组织1 g，置10 mL酶液(孙晓梅等, 2007)中暗中酶解不同时间，用200目尼龙网过滤混合液，离心5 min，依次加入21%的蔗糖和10%的甘露醇溶液，在1 000 rpm离心5 min，用吸管吸出原生质体。用血球计数器计算产量，荧光素双醋酸酯(FDA)染色法鉴定活性。

3.2.3原生质体的培养
采用悬滴培养、液体培养、固体培养、固液双层培养和看护培养5种培养方法，在胚性愈伤组织诱导培养基上进行原生质体培养，筛选最优培养方法；在最优培养方法中，以MS+不同浓度Picloram和6-BA (mg/L)的培养基上培养原生质体，筛选最优培养基，并在显微镜下观察原生质体的再生情况，照像。

作者贡献
秦晓杰、段金华和和凤美是本研究的实验设计和实验研究的执行人；秦晓杰和段华金是项目的构思者；朱永平完成数据分析；王小巧、李琼洁和赵兴富参与实验设计，试验结果分析；和凤美是项目的负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改；全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由云南省教育厅研究生项目(2011J093)、云南省教育厅项目(2011J093)和学生创新基金项目(NKZX2011CX023)共同资助。感谢云南农业大学国家级实验教学示范中心和农科专业基础实验教学示范中心提供资金支持。

参考文献
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