宁杂11号是半冬性甘蓝型杂交油菜新品种，由江苏省农业科学院经济作物研究所选育，具有高产、优质、早熟、适合机械化等优点(张洁夫等, 2009, 江苏农业科学, (5): 129-130)。该品种2007年通过国家审定(国审油2007007)、2008年通过江苏省审定(苏审油200803)、2009年通过江西省审定(赣审油2009005)、2010年通过安徽省认定，2008年转让给陕西荣华杂交油菜种子有限公司经营。

宁杂11号父本为甘蓝型油菜双低品系P10，母本为隐性核不育两用系G2AB，其中不育系G2A与可育保持系G2B比例为1:1，在杂交制种时必须拔除母本行中50%左右的可育株G2B，若拔除不彻底，最终收获的杂交种中就会混杂母本类型种子，从而影响杂交种的纯度。中国现行的油菜杂交种种子质量标准为纯度不低于90%，为了避免给种植户和种子公司带来不必要的损失和纠纷，在种子包装销售前，必须对种子的纯度进行鉴定。

鉴定油菜杂交种纯度的方法有很多，以往种子生产企业大多在青海、甘肃等地异地加代种植鉴定，但是种植鉴定方法比较费时费力，且部分年份鉴定效果不佳。近年来，随着植物分子检测技术的发展，分子标记技术越来越多的应用于油菜杂交种纯度的鉴定，成为种植鉴定的有效替代或补充。相比较AFLP、PAPD和SRAP等分子标记，SSR分子标记由于同时具有操作简便、重复性高和共显性等特点，成为分子标记鉴定油菜杂交种纯度的首选标记方法(谭祖猛等, 2008; 汤天泽等, 2008; 田筑萍等, 2008; 宋贤勇等, 2010)。

 本研究以杂交油菜品种宁杂11号为研究对象，利用SSR分子标记技术，建立了一套经济实用的宁杂11号杂交种纯度快速分子鉴定方法，为宁杂11号的良种生产和安全使用提供科学参考。

1结果与分析
1.1 SSR引物筛选
用宁杂11号的父本P10、不育系G2A、保持系G2B和杂交种F₁ (宁杂11号群体内30株可育株DNA混合) 4份DNA样本作模板筛选引物，筛选出的引物再用宁杂11号杂交种群体内30株可育单株验证，最终从144对油菜SSR引物中筛选出1对SSR引物Na10-E02，其扩增产物在P10、G2A和F₁中表现出共显性，能明显区分P10、G2A、G2B和F₁，在杂交种群体的30株可育株中，27株表现为杂种带型，3株表现为保持系G2B带型(图1)，这表明SSR引物Na10-E02可以应用于宁杂11号纯度检测。利用该引物进行多次扩增验证，结果稳定，重复性高。

图1 引物Na10-E02的扩增结果 注: M: 100 bp DNA marker; 1: P10; 2~5: G2A; 6~8: G2B; 9~39: 宁杂11号群体中的可育单株 Figure 1 Amplified results with SSR primer Na10-E02 Note: M: 100 bp DNA marker; 1: P10; 2~5: G2A; 6~8: G2B; 9~39: Fertile individual in Ningza No.11

1.2碱裂解法提取DNA
采用碱裂解法提取油菜种子DNA，只需将种子萌发去皮，大大缩短了样品准备的时间；与CTAB法相比，一次完整的DNA提取所需时间从2 h左右缩短到5 min；利用PCR板和PCR仪，单批次至少可以提取96个样品，操作简便高效。

SSR-RCR扩增结果表明，碱裂解法提取的油菜种子DNA完全能够满足PCR反应的需要，扩增产物电泳条带清晰，带型与CTAB法提取的油菜嫩叶DNA的扩增带型一致，而且对于不同批次提取的DNA，整体扩增成功率接近100% (图2)。

图2 简化法提取的DNA作模板的扩增结果 注: M: 100 bp DNA marker; 1~3: P10, G2A, F1; 其它: 宁杂11号样品 Figure 2 Amplified results of the template by simple method of extracting DNA Note: M: 100 bp DNA marker; 1~3: P10, G2A, F1; Others: Sample of Ningza No.11

1.3电泳与染色结果
SSR引物Na10-E02的扩增产物电泳条带呈共显性，分子量大小在110~150 bp之间，用8%的聚丙烯酰胺凝胶能够很好的分离。电泳结束后采用简化的银染法染色，固定染色同时进行，步骤简便，染色时间从至少30 min缩短到10 min左右，而且染色成功率高，条带清晰，分辨率高，完全能够满足位点记录和照相的需要(图1; 图2)。

1.4宁杂11号样品的分子标记检测
利用这套SSR标记快速检测方法对陕西荣华杂交油菜有限公司送测的9份样品分别进行纯度检测，统计有扩增条带的样品数和杂交带型样品数，计算杂交率，检测结果见表1。6份人工去杂的样品杂交率在87.15%~95.83%之间，3份化学杀雄样品的杂交率分别为94.79%、82.80%和37.10%。

表1 宁杂11号杂交种SSR分子标记鉴定结果与田间种植鉴定结果 Table 1 Identification results of hybrid seeds of Ningza No.11 by using SSR markers and planting in field

1.5宁杂11号样品的田间种植鉴定
将9份送测的宁杂11号样品在江苏省农业科学院溧水植物试验基地进行田间种植鉴定，直播不间苗，苗期去除明显杂株，初花期调查各样品总株数与不育株数，计算可育株率，统计结果见表1。6份人工去杂的样品可育株率在93.91%~97.05%之间，3份化学杀雄样品的可育株率分别为95.11%、92.34%和66.93%。

1.6纯度鉴定结果比较
田间鉴定不能区分宁杂1号杂交种群体内真杂种与保持系类型，只能调查育性，所以理论上田间鉴定的可育株率应大于实际的杂交率。将本次分子标记检测结果与田间种植鉴定比较，结果表明，田间鉴定的可育株率均大于分子标记鉴定的杂交率，与预期结果一致，除了纯度不合格的9号样品外，其他样品的两种鉴定结果之间差值在0.32%~9.54%之间；两种鉴定结果极显著正相关，相关系数达到0.984 (P<0.01)，决定系数R2=0.967 5，而且符合一次线性回归方程y=0.5093x+0.4892，表明可以借助分子标记检测的纯度结果来预测杂交种的实际田间纯度表现。

2讨论
杂交种的纯度向来都是杂交种子质量的一个关键指标，之前种子生产企业普遍采用异地加代种植鉴定的方法，但是异地鉴定时间较长，成本高，还存在种子发芽率不稳定、有些年份油菜不易通过春化等障碍，导致鉴定结果不可靠，所以近年来有不少种子企业与科研院校合作，用分子标记这一简便又可靠的方法来检测种子纯度。

要使分子标记技术能真正应用于杂交种纯度检测，必须建立一套快速、准确、简便的成套技术体系。本研究建立的宁杂11号杂交种纯度检测方法具有快捷、简便、高通量、检测结果准确的优点：从种子发芽到获得纯度结果在一天内完成；用碱裂解法粗提DNA，不需要磨样粉碎，不需要使用高速冷冻离心机，不需要使用氯仿等有毒化学试剂；结合PCR板操作，一个熟练科技人员每个工作日至少可以完成6×96=576粒种子的检测；分子标记检测结果与田间种植鉴定结果极显著正相关，且符合一次线性回归方程关系，可以利用分子标记检测结果来预测宁杂11号的田间实际纯度表现。

根据以上研究结论，本套快捷纯度检测方法可以用于宁杂11号杂交种的实际生产，对于样品分子标记检测纯度在85%以上的，生产上可以放心使用。制种企业可以利用分子标记检测结果及时对各制种区域收获的种子进行质量分级，制定不同收储价格，良种良储，及时淘汰纯度明显不达标种子，保障制种质量。

利用SSR分子标记进行杂交油菜种子纯度的快速鉴定，具有准确度高、成本低、快速简便等优点。随着分子生物学的深入发展，更多分子检测技术的开发应用及普及，在不久的将来，分子检测技术必将代替田间种植鉴定方法，在种子纯度鉴定、品种权保护、新品种注册等领域广范应用。

3材料与方法
3.1材料
试验材料由江苏省农业科学院经济作物研究所油菜研究室提供，宁杂11号父本P10取自2008年秋播宁杂11号制种大棚父本行，母本G2A为母本行中不育株，G2B为母本行中可育株，宁杂11号F₁群体为2009年夏收大棚制种种子。

待检测宁杂11号样品为陕西荣华杂交油菜种子有限公司陕西汉中制种基地2010年夏收种，共9份，其中1~6号为大田人工去杂制种种子，7~9号为化学杀雄制种种子。

3.2方法
采用SSR分子标记方法在实验室进行检测，同时结合田间种植鉴定作为对比验证。

3.2.1田间种植与取样
试验材料在江苏省农业科学院溧水植物科学试验基地种植。初花期取P10、G2A和G2B单株幼嫩叶片；2009年秋播种植宁杂11号F1群体，共4行，幼苗期间苗，每行留苗20棵左右，苗期、抽薹期调查其一致性，去除杂株，取其中30株可育单株的幼嫩叶片。

2010年秋播种植陕西荣华杂交油菜种子有限公司送检的9份样品做种植鉴定，每份直播4行，不间苗，分别于苗期、抽薹期调查其一致性，去除杂株，初花期调查育性。

3.2.2 DNA提取
宁杂11号亲本和F₁可育单株的叶片总DNA提取参照Murray和Thompson (1980)报道的CTAB法并作适当修改；样品种子的DNA提取采用碱裂解法：将种子在培养箱中发芽至露芽，去种皮，放入0.2 mL的96孔PCR板中，每管一粒，加入25 μL 0.25 mol/L NaOH，在PCR仪上99.9℃ 1 min，加入25 μL 0.25 mol/L HCl中和，再加25 μL 0.5 mol/L Tris-HC1 (pH 8.0)，99.9℃ 3 min，4℃保存，取浸出液作DNA模板。

3.2.3 SSR-PCR反应体系和程序
PCR反应采用本实验室2004年优化的SSR反应体系和程序(张洁夫等, 2004)。反应体系为DNA模板1 μL、上下游引物各0.2 μmol/L、1×PCR Buffer、2.0 mmol/L MgCl₂、200 μmol/L dNTPs、0.5 U Taq酶，ddH₂O补足10 μL。PCR扩增在MJ PTC-200 PCR仪上进行，程序为：94℃预变性4 min；94℃变性40 s，60℃ (-0.5℃/循环)退火30 s，72℃延伸40 s，10个循环；94℃变性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，25个循环；72℃延伸7 min；12℃保存。

3.2.4电泳和染色
PCR产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)：8%的29:1聚丙烯酰胺凝胶，电压8 V/cm，电泳90 min。采用简化的银染法染色：染色液(0.2% AgNO₃)染色6 min；水洗1次20 s；显影液(3% NaOH, 0.5%甲醛)显影，能清晰显示电泳条带后，用清水漂洗，取出照相和位点记录。

作者贡献
陈锋和张洁夫是本研究的实验设计和实验研究的执行人；陈松参与实验设计和试验结果分析；陈锋完成数据分析和论文初稿的写作；张洁夫、浦惠明指导实验设计，数据分析，论文写作与修改；张洁夫、戚存扣是项目的构思者及负责人。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由江苏省农业科技自主创新基金项目(CX(11)1026)、国家科技支撑计划(2010BAD01B10)和国家863重大项目(2011AA10A10403)共同资助。感谢江苏省农业科学院经济作物研究所油菜研究室研究生及科研辅助工在试验操作过程给予帮助；感谢陕西荣华杂交油菜种子有限公司提供检测样品。

参考文献
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