随着中国农业经济的发展和产业结构的调整，蔬菜生产的重要性越发受到重视(李巧英, 2009)，对种子质量的关注也日益提升。种子纯度鉴定是确保种子质量的重要环节。由于蔬菜种子繁育复杂、种类多，有限的亲本资源及新杂交品种的不断涌现，使品种间尤其是杂交种子间的遗传差异越来越小，蔬菜品种的真实性和纯度鉴定的难度逐渐增大(张颖等, 2008)。随着育种技术的不断创新和育种进程的加速，黄瓜新品种的数量近年来迅速增多，需要进行种子纯度鉴定的群体迅速扩大，而传统的种子形态鉴定、幼苗鉴定、物理化学鉴定、田间小区种植鉴定、蛋白质电泳和同工酶电泳鉴定等(李淑娟, 2003)传统方法很难高效地对其进行鉴定。另外传统鉴定方法费时、费工，存在着工作量大、鉴定周期长、表型特征会有一定程度偏差、易受主观因素和环境因素影响等缺点，不仅对品种纯度鉴定的准确性产生不利影响，也直接影响到后期良种的推广(王全等, 2009)以及新品种的选育。为了保护育种者以及农民的利益，发展快速、稳定、可靠的品种纯度鉴定方法具有重要的意义。

分子标记技术的出现和快速发展为种子的纯度鉴定提供了一种更为快速、准确、稳定的方法(郑成超和温孚江, 1997; 戚华雄等, 1999; 方宣钧等, 2000; Yashitola et al., 2002)。DNA分子标记是建立在DNA序列多态性基础之上反映生物个体之间或种群之间具有差异性状的DNA片段，是基因的直接反应，具有多态性高、稳定性高、数量丰富、可以在植株生长的任何阶段进行，鉴定快速，并不受基因表达和环境条件的影响等优点而逐渐得到应用。其中，SSR分子标记因数量丰富、多态性高、共显性遗传(李召华等, 2006)、稳定性高、操作简单、重复性好、对DNA质量要求较低等特点，能准确高效地鉴别大量等位基因，为种子的纯度鉴定提供了一种更为快速、高效、简便、可靠的方法(李巧英, 2009)，已经越来越广泛地应用于大豆(关荣霞等, 2003)、玉米(李艺等, 2008)、水稻(陈年伟等, 2009; 郭承亮等, 2011, 中国种业, (11): 40-43)、棉花(郭承亮等, 2012)、大白菜(管志坤等, 2011)、豇豆(鲁忠富等, 2010)、西瓜(Ai et al., 2006)、黄瓜(张桂华等, 2010, 北方园艺, (12): 140-141)、甜瓜(柳剑丽等, 2006; 刘爱群等, 2012)等植物种子纯度鉴定。SSR分子标记技术在黄瓜杂交种子纯度鉴定中的应用将对规范黄瓜种子产业，促进农业增产、农民增收具有重要意义。

本研究以浙江省农业科学院选育的黄瓜品种‘浙秀1号’及其亲本为试验材料，利用SSR技术进行种子纯度鉴定研究，利用SSR引物，通过比较杂交种及双亲的特征谱带，筛选杂交种呈现双亲共显性的互补带型的引物，筛选其特异谱带，并以该谱带作为分子标记对其黄瓜种子纯度进行鉴定，建立准确快速的黄瓜杂交种种子纯度检测体系，为黄瓜杂交种种子纯度分析提供理论基础。

1结果与分析
1.1黄瓜基因组DNA的提取
本研究采用CTAB法对黄瓜基因组DNA进行提取。利用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行DNA电泳检测，由电泳结果可以看出，提取的DNA条带清晰完整，纯度较高，没有明显降解，可用于下一步PCR扩增(图1)。

图1 黄瓜基因组DNA电泳图 注: 1:‘浙秀1号’; 2: 母本‘XH65’; 3: 父本‘XD23’; 4~8: 其他自交系 Figure 1 Electrophoretogram of cucumber genomeogram Note: 1: ‘Zhexiu 1’ hybrid; 2: Female line‘XH65’; 3: Male line ‘XD23’; 4~8: Other inbred lines

1.2 SSR引物筛选
利用SSR分子标记技术对黄瓜品种‘浙秀1号’及其亲本DNA样本进行分析。选用699对SSR引物进行PCR扩增，筛选杂交种与父母本呈现共显性互补带型分离的引物组合，经过多次重复和比较，最终确定带型清晰、稳定性好的引物作为检测杂交种纯度的特异引物。找到在‘浙秀1号’及其双亲中表现共显性分离的引物3对(CSⅣ-37.2-F770, CSⅥ- 24.9-F757和CSⅤ-18.5-F664)，引物序列如表1所示。杂交种的带型为父母本的互补型(图2)，条带清晰明亮，带型差异明显，重复性高，用不同批次试剂和进行不同批次PCR扩增均得出相同的扩增产物电泳谱带。

图2 引物的杂交种带型为父母本互补型 注: 1: ‘浙秀1号’; 2: 母本; 3: 父本; A: 引物CSⅥ-37.2-F770; B: 引物CSⅥ-24.9-F757; C: 引物CSⅤ-18.5-F664 Figure 2 SSR profile of ‘Zhexiu 1’hybrid and its parental lines amplified by three pairs of primers Note: 1: ‘Zhexiu 1’ hybrid; 2: Female line; 3: Male line; A: CSⅥ- 37.2-F770; B: CSⅥ-24.9-F757; C: CSⅤ-18.5-F664

SSR为共显性标记，所有杂交组合均是父母本条带的完全互补型，可以很好地区分杂交组合和父母本，而且多态性高，是纯度鉴定理想的分子标记。

1.3黄瓜种子纯度鉴定
利用筛选出来的引物CSⅥ-37.2-F770、CSⅥ- 24.9-F757和CSⅤ-18.5-F664分别对‘浙秀1号’100粒种子及10份自选黄瓜自交系种子进行纯度鉴定，试验用的模板DNA来自种子萌发的幼苗(图3; 图4; 图5)。

图3 杂交种‘浙秀1号’的纯度鉴定(引物为CSⅥ-37.2-F770) 注: M: DL1000 marker; 1~20: ‘浙秀1号’; 21: 母本‘XH65’; 22: 父本‘XD23’; 23~26: 其他自交系 Figure 3 Amplification results of primer CSⅥ-37.2-F770 Note: M: DL1000 marker; 1~20: ‘Zhexiu 1’ hybrid; 21: Female line ‘XH65’; 22: Male line ‘XD23’; 23~26: Other inbred lines

图4 杂交种‘浙秀1号’的纯度鉴定(引物为CSⅥ-24.9-F757) 注: M: DL1000 marker; 1~20: ‘浙秀1号’; 21: 母本‘XH65’; 22: 父本‘XD23’; 23~26: 其他自交系 Figure 4 Amplification results of primer CSⅥ-24.9-F757 Note: M: DL1000 marker; 1~20: ‘Zhexiu 1’ hybrid; 21: Female line ‘XH65’; 22: Male line ‘XD23’; 23~26: Other inbred lines

图5 杂交种‘浙秀1号’的纯度鉴定(引物为CSⅤ-18.5-F664) 注: M: DL1000 marker; 1~20: ‘浙秀1号’; 21: 母本‘XH65’; 22: 父本‘XD23’; 23~26: 其他自交系 Figure 5 Amplification results of primer CSⅤ-18.5-F664 Note: M: DL1000 marker; 1~20: ‘Zhexiu 1’ hybrid; 21: Female line ‘XH65’; 22: Male line‘XD23’; 23~26: Other inbred lines

利用引物CSⅥ-37.2-F770、CSⅥ-24.9-F757和CSⅤ-18.5-F664对‘浙秀1号’100粒种子的纯度进行检测，3对引物获得的鉴定结果分别为100%、99%和99%，而‘浙秀1号’100粒种子纯度的田间鉴定结果为98%，分子标记方法检测结果与田间鉴定结果基本一致。同时，利用筛选到的3对引物对‘浙秀1号’和10份自选自交系种子进行检测，通过带型比较，3对引物均能够准确区分‘浙秀1号’种子与其他自选自交系种子，准确率为100%，并且与田间鉴定结果完全一致，从而确定了3对引物的适用性，说明利用SSR方法检测黄瓜‘浙秀1号’杂交种子纯度是完全可行的。

表1 引物序列 Table 1 Primer sequences

2讨论
纯度是种子质量的一个核心指标，种子在出售之前，都要进行纯度检测。在种子纯度检测过程中，如果对种子直接进行检测，会因种子的发芽率问题，而导致室内检测结果与田间种植结果之间存在一定的偏差(王全等, 2009)。为避免因发芽率不同而产生的误差，本研究所用的材料为黄瓜幼苗，即利用种子发芽率、发芽势测定之后的材料进行纯度检测，不仅消除了发芽率的影响、反映出种子纯度的真实情况，而且兼顾了种子发芽率、发芽势的测定。既避免了种子浪费，又节省了两者分别测定所需重新催芽的时间。

DNA分子标记技术中，SSR分子标记技术不受环境条件影响，多态性高，重复性稳定，且价格低廉，操作简便，同时是共显性标记，因此已广泛应用于杂交种纯度鉴定。杂交种种子纯度鉴定时有效SSR引物越多，鉴定结果越可靠，但在实际操作中应考虑到所需的成本和花费的时间，都希望利用最少的标记就能准确地鉴定种子纯度，对于大群体检测尤为显著。从原理上讲，如果混入的是所鉴定杂交种子的父本或母本材料，则单个标记与多个标记的检测结果将完全一致，但如果混入的是其它杂交种子或其他杂合型材料，则不同标记座位的检测结果可能出现差异。在实际育种生产过程中，黄瓜杂交种的种子纯度问题主要来自于制种过程中杂交种与亲本种子的混杂，黄瓜杂交种种子纯度鉴定主要是对杂交种与亲本种子进行区分鉴定(王全等, 2009)，因此选用1对有效的SSR引物即可快速鉴定黄瓜杂交种种子纯度。

本研究应用筛选出来的3对SSR引物CSⅥ-37.2-F770、CSⅥ-24.9-F757和CSⅤ-18.5-F664可对100粒黄瓜种子纯度及10份自选黄瓜自交系种子进行种子纯度鉴定，并且SSR分子标记鉴定结果与田间形态观察鉴定结果一致，即所建立的鉴定体系可以直接用于‘浙秀1号’黄瓜种子纯度检测，该技术在不计DNA提取过程耗时的情况下，在4 h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、方便、成本低的优势，克服了田间鉴定过程复杂、周期长、易受环境条件影响等缺点，实现品种纯度的分子标记辅助鉴定。

3材料与方法
3.1试验材料
供试黄瓜品种为‘浙秀1号’及其亲本，由浙江省农科院蔬菜所提供。699对供试SSR引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增试剂由上海生工生物工程技术服务有限公司提供，其他试剂均为分析纯。SSR分子标记鉴定群体为100粒‘浙秀1号’黄瓜种子及10份自选黄瓜自交系种子。

3.2试验方法
3.2.1 DNA提取
将供试黄瓜种子催芽后培养于28℃的恒温箱中，于1片真叶期进行取样，利用CTAB法(王宏建等, 2006)提取杂交种及其亲本叶片的DNA。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，然后将DNA浓度调节至60 ng/μL备用。

3.2.2 PCR扩增
PCR扩增反应总体系为20 μL，扩增反应体系成分如下：黄瓜基因组DNA 20 ng，10 pmol/μL引物各0.4 μL，2.5 mmol/L Mg²⁺ 2 μL，2 mmol/L dNTP 1 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.1 μL，10×Buffer 2 μL，无菌重蒸水补齐至20 μL。

PCR反应扩增程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。

3.2.3扩增产物的检测与引物的筛选
在20 μL的PCR扩增产物中加入8 μL Loading Buffer，94℃变性5 min后，迅速置于冰上冷却。利用6%聚丙烯酰胺凝胶对扩增产物进行分离，上样量为6 μL，在100 W功率下电泳1 h左右。对电泳后的凝胶进行银染检测，在5%冰醋酸固定20 min，蒸馏水水洗10 min，然后用银染液(硝酸银溶液4.5 g＋甲醛溶液4.5 mL＋蒸馏水3 000 mL)染色20~30 min，蒸馏水水洗5~6 s后用显影液(硫代硫酸钠溶液400 μL＋无水碳酸钠70 g＋甲醛溶液3 mL＋蒸馏水2 000 mL)显影，待影像清晰后，放入固定液中固定。用蒸馏水水洗后置于通风处风干，观察记录带型，筛选出杂交种带型为父母本互补型、且重复性好的SSR分子标记引物。

3.2.4特异谱带的验证
利用筛选出的特异引物，对100粒‘浙秀1号’黄瓜种子和10份自选黄瓜自交系种子进行SSR鉴定，并将鉴定结果与田间鉴定结果对比，确定筛选到的SSR引物的可靠性与适用性。

作者贡献
周胜军、张鹏是本研究的实验设计和实验研究的执行人；张鹏和朱育强完成数据分析，论文初稿的写作；陈新娟和陈丽萍参与实验设计，试验结果分析；周胜军是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由浙江省农业新品种选育重大科技专项(2012C12903)和杭州市种子种苗项目(2011R23A70D03)共同资助。作者对浙江省农业科学院蔬菜所在本研究过程中提供的试验材料表示感谢。

参考文献
Ai C.X., Yu X.M., Liu Q.Z., and Zheng F.C., 2006, Seed purity test of hybrid varieties of watermelon by SSR marker, Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 26(10): 2006-2010

Chen N.W., Zhang T.G., Xu C.N., Yu A., Lin Q., and Xiao H., 2009, Identification and purity test of hybrid rice with SSR molecular markers and field planting, Xi'nan Nongye Xuebao (Southwest China Journal of Agricultural Sciences), 22(3): 553-555 (陈年伟, 张体刚, 徐昌能, 余敖, 林琦, 肖华, 2009, SSR分子检测与田间种植鉴定杂交稻种子纯度的研究, 西南农业学报, 22(3): 553-555)

Fang X.J., Liu S.H., and Jiang S.Y., 2000, Progress on identification of seed purity and authenticity using DNA molecular markers, Nongye Shengwu Jishu Xuebao (Journal of Agricultural Biotechnology), 8(2): 106-110 (方宣钧, 刘思衡, 江树业, 2000, 品种纯度和真伪的DNA分子标记鉴定及其应用, 农业生物技术学报, 8(2): 106-110)

Guan R.X., Liu Y., Liu Z.X., Chang R.Z., and Qiu L.J., 2003, Purity identification of soybean varieties with SSR technique, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 1(3): 357-360 (关荣霞, 刘燕, 刘章雄, 常汝镇, 邱丽娟, 2003, 利用SSR方法鉴定大豆品种纯度, 分子植物育种, 1(3): 357-360)

Guan Z.K., Luo S.X., Li Y.X., Chen X.P., Wang Y.H., Gu A.X., and Shen S.Q., 2011, Purity identification of Chinese cabbage cultivar Youlv No.3 using SSR marker, Zhongzi (Seed), 30(9): 34-35 (管志坤, 罗双霞, 李艳霞, 陈雪平, 王彦华, 顾爱侠, 申书兴, 2011, 利用SSR标记鉴定油绿3号大白菜品种纯度, 种子, 30(9): 34-35)

Guo C.L., Xu S.Q., Luo Q.S., Zhou H.X., Li Y.C., and Wang J., 2012, Identification and purity test of hybrid cotton with SSR molecular markers, Zhongzi Keji (Seed Science & Technology), 30(6): 21-23 (郭承亮, 许双全, 罗青山, 周厚雄, 李艳春, 王菁, 2012, 利用SSR标记鉴定棉花杂交种子纯度的研究, 种子科技, 30(6): 21-23)

Li Q.Y., 2009, The research of SSR markers in identification of seed purity, Zhongguo Zhongye (China Seed Industry), (11): 22-24 (李巧英, 2009, SSR标记技术在种子纯度鉴定中的研究进展, 中国种业, (11): 22-24)

Li S.J., 2003, Summary of identification method on seed purity, Qinghai Daxue Xuebao (Journal of Qinghai University (Natural Science Edition)), 21(1): 16-19 (李淑娟, 2003, 种子纯度鉴定方法概述, 青海大学学报(自然科学版), 21(1): 16-19)

Li Y., Tie S.G., Zhu W.H., Qi J.S., Lu C.X., Sun J.J., and Zhou K., 2008, Selection of SSR markers for Zhengdan 958 maize hybrid seed purity identification, Yumi Kexue (Journal of Maize Sciences), 16(1): 40-43 (李艺, 铁双贵, 朱位红, 齐建双, 卢彩霞, 孙建军, 周柯, 2008, 鉴定玉米杂交种郑单958种子纯度的SSR标记筛选, 玉米科学, 16(1): 40-43)

Li Z.H., Zhu K.Y., Chen Z.W., and Zhan Q.C., 2006, Application of SSR molecular marker on purity identification of hybrid rice seeds, Zajiao Shuidao (Hybrid Rice), 21(4): 11-14 (李召华, 朱克永, 陈祖武, 詹庆才, 2006, SSR分子标记技术在杂交水稻种子纯度鉴定中的应用, 杂交水稻, 21(4): 11-14)

Liu A.Q., Zhao L.L., Wang G.Z., and Zhao Y., 2012, Research progress of using molecular markers to identify seed purity of Cucurbitaceous plants, Changjiang Shucai (Journal of Changjiang Vegetables), (8): 6-10 (刘爱群, 赵丽丽, 王国政, 赵越, 2012, 分子标记鉴定葫芦科瓜类作物种子纯度的研究进展, 长江蔬菜, (8): 6-10)

Liu J.L., Zhou S.C., Song X.H., and Wang J.S., 2006, Purity test of melon hybrid with SSR molecular markers, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 4(6S): 23-26 (柳剑丽, 周寿春, 宋晓华, 王建设, 2006, 利用SSR标记鉴定甜瓜杂交种的种子纯度, 分子植物育种, 4(6S): 23-26)

Lu Z.F., Xu P., Wang B.G., Liu Y.H., Wu X.H., Hu T.T., and Li G.J., 2010, A rapid and precise SSR-based procedure for seed quality surveying of Vigna unguiculata ssp. sesquipedalis (L.) Verd., Zhejiang Nongye Xuebao (Acta Agricul- turae Zhejiangensis), 22(6): 727-730 (鲁忠富, 徐沛, 汪宝根, 刘永华, 吴晓花, 胡婷婷, 李国景, 2010, 基于SSR分子标记技术的长豇豆种子纯度快速鉴定技术, 浙江农业学报, 22(6): 727-730)

Qi H.X., Yang S.L., Wang B., and Lu X.G., 1999, Identification of hybrid rice seed using PCR techniques, Hubei Nongye Kexue (Hubei Agriculture Sciences), (1): 12-14 (戚华雄, 杨蜀兰, 王斌, 卢兴桂, 1999, 用聚合酶链式反应技术鉴定杂交稻种子纯度的初步研究, 湖北农业科学, (1): 12-14)

Wang H.J., Wu Y., Gu W., Sun X.D., and Qin Z.W., 2006, Extraction of DNA from cucumber by improved CTAB method, Heilongjiang Nongye Kexue (Heilongjiang Agricultural Sciences), (5): 124-125 (王宏建, 吴越, 谷维, 孙晓丹, 秦智伟, 2006, 改进的CTAB法提取黄瓜DNA, 黑龙江农业科学, (5): 124-125)

Wang Q., Zhang G.H., and Miao W.L., 2009, Purity identification of cucumber hybrid seeds using SSR technology, Chang- jiang Shucai (Journal of Changjiang Vegetables), (7): 43-44 (王全, 张桂华, 苗伟利, 2009, 应用SSR技术进行黄瓜杂交种种子纯度鉴定, 长江蔬菜, (7): 43-44)

Yashitola J., Thirumurugan T., Sundaram R.M., Naseerullah M.K., Ramesha M.S., Arma S.N.P., and Sonti R.V., 2002, Assessment of purtity of rice hybrid using microsatellite and STS markers, Crop Science, 42(4): 1369-1373

Zhang Y., Cao D.D., Huang X.X., Qu C.R., Guan Y.J., Hu J., 2008, Progress of molecular markers technology on vegetable variety and seed purity identification, Zhongzi (Seed), 27(5): 51-55 (张颖, 曹栋栋, 黄歆贤, 屈长荣, 关亚静, 胡晋, 2008, 应用分子标记进行蔬菜品种和种子纯度鉴定的研究进展, 种子, 27(5): 51-55)

Zheng C.C., and Wen F.J., 1997, Application prospects of DNA molecular markers in identifying the purity of crop seeds, Shandong Nongye Daxue Xuebao (Journal of Shandong Agricultural University), 28(4): 499-505 (郑成超, 温孚江, 1997, DNA分子标记技术与作物品种纯度鉴定, 山东农业大学学报, 28(4): 499-505)